Bu protokol, siRNA'ları yüksek verimlilikle sunarak in vivo genleri susturabilen bir nanopartikül sisteminin sentezini tanımlar. Sadece hedefleme peptid ve siRNA yükü değiş tokuş ederek, fusojenik nano tanecikleri in vivo gen modülasyonu gerektiren hastalıklar için potansiyel bir terapötik formülasyon olarak kullanılabilir. Daha önce kronik iltihabı sonlandırmak için makrofajlarda iltihabı kodlayan bir geni susturarak gram-pozitif bakteriyel enfeksiyonlara karşı fusojenik nanoplatform kullanarak sonuçlar yayınladık.
Bu işlemi gerçekleştirmeden önce, üçe bir hidroflorik asit çözeltisinde silikon gofret içeren bir Teflon etch hücresi monte edin. 0,6 saniye kare lik 50 miliamperes santimetre kare lik bir kare dalga formu ve 500 döngü için tekrarlanan 0,36 saniye boyunca santimetre kare simetre başına 400 miliamperes yüksek akım yoğunluğu ile alternatif bir akım çalıştırın. Gravür bittikten sonra, hücreyi devreden çıkarın ve hidroflorik asit çözeltisini bir şırınga kullanarak dikkatlice durulayın.
Sonra, etanol ile üç kez durulayın. Silikon gofret gözenekli tabaka kaldırmak için, ilk bir-to-29 hidroflorik asit çözeltisi 10 mililitre ile etch hücre kuyusu doldurun. Daha sonra, 250 saniye boyunca santimetre kare başına 3,7 miliamperes sabit çalıştırın.
Gravür bittikten sonra, hücreyi devreden çıkarın. Gözenekli silikon tabakası, kristal silikon gofret ten kopma gösteren görünür dalgalanmalar olabilir. Hidroflorik asit çözeltisini hafifçe yıkayın ve her biri etanol ve suyla üçer kez durulayın.
Bir pipet ucu kullanarak, tam bir kopuş için gözenekli silikon tabakasının çevresini sıkıca kırın. Etanol kullanarak, gözenekli silikon parçaları toplamak, veya cips, Teflon etch hücreden bir tartMa tekne içine. Sonra, depolama için bir cam şişe için cips aktarın.
Daha sonra, gözenekli silikon yongaları içeren cam şişedeki etanolü iki mililitre RNase içermeyen su ile değiştirin. Sıkıca kap ve Parafilm kullanarak şişe mühür. Bir sonicator banyoda cam şişe yerleştirin ve gözenekli silikon yongaları hacmi tamamen su banyosu yüzeyinin altında batırılmış olduğu gibi askıya aldı.
Sonication sırasında önemli su kaybını önlemek için, şişenin açılması su banyosu yüzeyine dokunur şekilde ters, su dolu bir hacimsel şişe yerleştirin. Daha sonra, 48 watt rf gücü ile 35 kilohertz 12 saat boyunca gözenekli silikon yongaları sonicate. Sonication sonra, büyük parçacıklar alt yerleşmek için izin vermek için bir saat düz bir yüzeye cam şişe yerleştirin.
Sonra, bir pipet kullanarak supernatant toplamak. Bir cam şişede, 72,55 mikrolitre DMPC çözeltisi, 15,16 mikrolitre DSPE-PEG çözeltisi ve 19,63 mikrolitre DOTAP çözeltisi ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Çözücü bir gecede buharlaşmasını sağlamak için gevşek bir kapak ile bir duman kaputuna şişe yerleştirin.
Kurutulmuş film, şişenin altında bulutlu, sert, jel benzeri bir madde olacak. Sonra, daha önce hazırlanmış buzlu sonication banyo gözenekli silikon nano tanecikleri 150 mikrolitre içeren bir mikrosantrifüj tüp yerleştirin. 15 dakikalık ultrasonication altında, hafifçe pipet 150 siRNA mikrolitre ve gözenekli silikon nano tanecikleri içine iki molar kalsiyum klorür 700 mikrolitre.
Sonicator siRNA yüklü kalsiyum kaplı gözenekli silikon nano tanecikleri bir mililitre içeren tüp çıkarın. Geniş bir kabı deiyonize suyla doldurun. Bir polikarbonat membran ve dört filtre desteklerini su yüzeyinde yüzdürerek ıslatın.
Daha sonra, üreticinin talimatlarına uyarak bir lipozom ekstrüzyon kiti monte edin. Daha sonra, siRNA yüklü kalsiyum kaplı gözenekli silikon nano tanecikleri bir mililitre ile cam şişe kurutulmuş lipid film nemlendirin. Pipet, tüm lipidler şişenin altından kaldırılıncaya ve bulutlu, homojen bir çözelti gözlenene kadar.
Cam şişeye manyetik karıştırma çubuğu ekleyin ve şişeyi sıcak bir plakaüzerine yerleştirin ve parçacıkları manyetik olarak 20 dakika boyunca karıştırarak 40 santigrat dereceye ısıtın. Bunu takiben, ekstrüderin bir tarafına boş bir şırınga takın. Daha sonra, lipid kaplı gözenekli silikon nanopartikül çözeltisi bir mililitre ile başka bir şırınga doldurun ve ekstrüder diğer tarafına şırınga takın.
Bir şırıngadan parçacıkları, polikarbonat membranı ve diğer şırınga içine itmek için yavaş yavaş piston iterek ekstrüzyon başlayın. 20 kez tekrarlayın. Sonra, bir mikrosantrifüj tüp içine ekstrüzyon parçacıkları toplamak.
RNase içermeyen suda mililitre başına bir peptit konsantrasyonu olan bir peptit stoku hazırlayın. Fusojenik lipid kaplı gözenekli silikon nano tanecikleri içeren mikrosantrifüj tüpünde, peptit stokunun 100 mikrolitresini ve pipeti hafifçe ekleyin. Tüpü oda sıcaklığında 20 dakika sabit tutun.
Aşırı peptid veya siRNA ve diğer eksipiyanları gidermek için, oda sıcaklığında 5,000 kez g'de bir saat boyunca eğilerek 30 kilodalton luk bir santrifüj filtrede yıkayın. Aynı ayarlar altında bir mililitre PBS ile iki kez daha santrifüj yapın. Santrifüjden sonra, PBS'deki son peptid konjuge fusojenik lipid kaplı gözenekli silikon nano partikülleri istenilen konsantrasyonda yeniden askıya alın.
Parçacıklar en az 30 gün boyunca eksi 80 derecede saklanabilir. Fusojenik gözenekli silikon nano tanecikleri başarılı bir sentezi 30 gün boyunca saklanabilir ve yapısal değişikliklere neden olmadan çözülmüş homojen, biraz opak bir çözüm üretmelidir. Oran ve konsantrasyonun optimize edilmemesi ve tekrarlanan donma-çözülme döngüleri yükleme üzerine toplanmaya yol açabilir.
Parçacıklar ekstrüzyon olarak, dinamik ışık saçılma ile ölçülen fusojenik gözenekli silikon nano tanecikleri ortalama hidrodinamik çapı yaklaşık 200 nanometre ve ortalama zeta potansiyeli yaklaşık yedi milivolt olmalıdır. Hedefleme peptidleri ile yüzey modifikasyonundan sonra, toplam çapı 230 nanometreden az olmalı ve ortalama zeta potansiyeli eksi 3,4 milivolta düşer. Füzyon, fusojenik lipit lipidlerin lipophilic florofor DiI ile etiketlenmesi ve konfokal mikroskopi ile in vitro lokalizasyonun gözlemlenmesi ile doğrulanabilir.
Fusojenik gözenekli silikon nanopartikülün lipitlerinin DiI'yi plazma zarına aktarması ve izozomlardan bağımsız olarak lokalize olması yla başarılı füzyon gözlenir. Başarısız füzyon hücrenin sitoplazması içinde DiI lokalizasyonunu ve lizozomlarla birlikte lokalizasyonunu gösterecektir. Bu fusogenic nanopartikül sistemi şimdi sadece bakteriyel enfeksiyonlar değil, aynı zamanda kanser adjuvan tedavi ve kanser immünoterapi terapötik uygulamalar için kullanılmaktadır.
Bu protokol, siRNA'lardan daha fazla yüklemek için daha iyi duruma getirilebilir. Fusojenik nanopartikül sistemi, mRNA'lar ve CRISPR/Cas9 kompleksleri gibi daha büyük aniyonik yüklerin yüklenmesi ve teslimi potansiyelini göstermiştir.
