SEC profili, bir proteinin kalitesini analiz etmenin güçlü bir yoludur. Amaç, numune kalitesi hakkında bilgi verebilecek floresan kullanarak bir membran proteini için bir SEC profili toplamaktır. FSEC az miktarda numune kullanır ve saflaştırma için gerçekleştirilebilir, nispeten basittir ve birçok laboratuvarda bulunan ekipmanlarda gerçekleştirilebilir.
Prosedürü gösteren, Peak Proteins'ten Kıdemli Protein Bilimcisi Jack Wright olacak. Oda sıcaklığında eksi 80 santigrat derecede saklanan hücre paletini 15 dakika boyunca veya numune donmayana kadar çözerek hücre paletlerinin hazırlanmasına başlayın. Numuneyi hemen buza taşıyın.
Numuneyi yeniden askıya almak ve çözündürmek için, hücre paletine iki mililitre çözündürme tamponu ekleyin. 15 ila 30 dakika boyunca dört santigrat derecede uçtan uca ters çevirme ile inkübe edin. Daha sonra,% 1 dodesil maltosid veya DDM ve% 0.1 kolesterol hemisuksinat veya CHS'nin nihai konsantrasyonunu yapmak için önceden karıştırılmış deterjan stoğu ekleyin.
Dört santigrat derecede uçtan uca ters çevirme ile 30 dakika boyunca çözün. Düşük hızlı bir santrifüjleme adımı gerçekleştirmek için, numuneyi bir salınımlı kova kullanarak tezgah üstü bir santrifüjde santrifüj edin ve 15 dakika boyunca 2000 g'da santrifüj yapın. Daha sonra, beş mililitrelik bir şırıngaya tutturulmuş kör uçlu bir iğne kullanarak süpernatantı düşük hızlı santrifüjlemeden ultra santrifüjleme tüplerine aktararak yüksek hızlı santrifüjleme gerçekleştirin.
Paleti rahatsız etmediğinizden emin olun. Tüp çiftlerini dengeledikten sonra, sabit açılı ultra santrifüjleme rotoruna yerleştirin ve 250.000 g'da 30 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj. Hızlı protein sıvı kromatografisini veya FPLC sistemini, sistemi boyut dışlama kromatografisi veya SEC tamponu ile doldurarak ve hava pompalarını temizleyerek hazırlayın.
SEC sütununu FPLC'ye bağlayarak kolona hava girmemesini sağlayın. SEC kolonunu, laboratuvar sınıfı damıtılmış ve filtrelenmiş suyun 1,5 katı sütun hacminde yıkayarak ve ardından kolon için önerilen akış hızında ve basınçta 1,5 kat sütun hacminde SEC tamponunda yıkayarak önceden dengeleyin. SEC deneyini çalıştırmak için, süpernatantı yüksek hızlı santrifüjleme adımından şırıngaya tutturulmuş kör uçlu bir iğne kullanarak bir mililitrelik bir şırıngaya aktarın.
Örnek döngüyü yüklenecek şekilde ayarlayın. Şırıngadan yükleme portuna 600 ila 700 mikrolitre numune enjekte ederek 500 mikrolitrelik bir numune döngüsünü aşırı doldurun. Daha sonra, numuneyi döngüden önerilen akış hızı ve basınçta dört mililitre SEC tamponu ile boşaltarak sütuna enjekte edin.
Kolonu tampon hacminin 1,5 katı geçene kadar aynı akış hızında çalıştırın ve sütun hacminin 0,25 katını geçtikten sonra 0,2 mililitrelik 90 fraksiyon toplamaya başlayın. Çok kanallı pipet kullanarak 90 mikrolitre laboratuvar sınıfı damıtılmış suyu bir rezervuardan opak, düz tabanlı, 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın. Daha sonra numunelerin 10 mikrolitresini 96 delikli bir plakadan opak, düz tabanlı, 96 delikli plakaya aktarın ve kuyu plakasını bir plaka okuyucusuna yerleştirin.
Floresan etiketli GFP için, uyarımı 488 nanometreye mümkün olduğunca yakın tutun ve sinyali ölçmeden önce floresan emisyonunu 507 nanometreye mümkün olduğunca yakın tespit edin. Dinamik aralığın ve gelişmiş yeşil floresan proteininin alt sınırlarının veya plaka okuyucu için EGFP tespitinin araştırılması, plaka okuyucunun sinyal doygunluğundan önce 30 nanogramlık bir alt algılama sınırına ve 500 nanograma kadar EGFP etiketli proteinin dinamik aralığına sahip olduğunu göstermiştir. Elüsyon hacimlerinin Kav'a dönüştürülmesi ve log moleküler ağırlıklarına karşı çizilmesi, standart eğrinin enterpolasyonu ile G-proteinine bağlı reseptörlerin moleküler ağırlığının tahmin edilmesine izin verdi.
Optimal membran ekstraksiyon koşulları, DDM ve lauril maltoz neopentil glikolün, stiren maleik asit kopolimeri ile deterjansız ekstraksiyona karşı test edilmesiyle araştırılmıştır. Ligand ilavesinin floresan boyut dışlama kromatografi profili üzerindeki etkisi, çözünme sırasında numuneye sfengosin-1-fosfat veya S1P eklenerek araştırılmıştır. S1P varlığında çözünen numune, azaltılmış agregasyon ile üstün bir iz gösterdi.
Serotonin reseptörü 5HT2AR'nin farklı koşullar altında uzun süreli stabilitesinin araştırılması, stiren maleik asit lipit parçacıklarındaki proteinin, elverişsiz sıcaklıklarda bile daha uzun süre stabil kaldığını göstermiştir. Çözünürlük noktası ile SEC sütunundan geçen numune arasındaki süre zaman açısından kritiktir. Duraklama olmamalı ve numune soğuk tutulmalıdır.
FSEC'i takiben, en iyi yapı, deterjan veya tamponun anlaşılması kazanılacaktır. Bu, protein saflaştırmasının optimize edilmesini sağlar ve aşağı akış biyofiziksel ve yapısal karakterizasyonunu destekler.
