Fare organoid kültürleri geleneksel hücre kültürlerine göre in vivo hücre organizasyonuna daha çok benzer. Kanser araştırmalarında, organoidler orijinal tümörü 2D hücre çizgilerinden daha iyi modeller ler ve yeni ilaç tedavileri geliştirmek için potansiyel kanser tedavilerini in vitro test etmek için kullanılabilirler. Erkek fare ürogenital sistemin en blok çıkarma için mesane her iki tarafında yağ yastığı kavramak ve testis ortaya çıkarmak için yukarı çekin.
Her testisi ürogenital bölgenin geri kalanından dikkatlice inceleyin. Mesaneyi yavaşça kaldırın, böylece ürogenital bölge birlikte yükselmiş ve altındaki üretrayı açığa çıkar. Mesane tutarken, üretra incise dorsal prostatın alt karşı makas yönlendirmek.
Tüm ürogenital bölge karın boşluğundan salınacak. Ürogenital sistem çıkarıldıktan sonra, ürogenital sistemin hemen arkasında ve omurganın her iki tarafında konumlandırılmış pelvik lenf düğümleri maruz kalacaktır. Lenf düğümleri kaldırmak için lenf dokusunun altında düz forseps yönlendirmek ve yukarı çekin.
Sonra, düz forseps ve kesme ile rektum kavramak, mezenterik lenf düğümlerinde metastatik lezyonlar aramak için tüm kolon ve ince bağırsak çözmek için rektum yukarı çekerek. Tüm ilium çıkarıldığında mide maruz kalmak için duodenum çekmeye devam edin. Tamamen mide kaldırmak için yemek borusu kesin.
Lenf düğümlerinde herhangi bir metastatik lezyon gözlenirse, PBS'de depolanması için bu düğümleri bağırsaktan dikkatlice inceleyin. Mide çıkarıldığında, dalak% 4 paraformaldehit depolama için karın sırt tarafında hasat edilebilir. PBS depolama için karaciğer çıkarın.
Metastatik lezyonlar içeren herhangi bir böbrek lenf düğümleri ile birlikte omurganın her iki tarafında böbrekler çıkarın. Göğüs boşluğu ortaya çıkarmak için dikkatle göğüs kafesi boyunca diyafram kesti. Göğüs boşluğunda salınan negatif basınç kalp ve akciğerleri ortaya çıkaracaktır.
Göğüs kafesini daha da açmak için göğüs kafesini yukarı çekin. Varsa diseksiyon için göğüs kafesi boyunca torasik kavitenin ventral yüzünü torasik lenf düğümlerinde metastatik lezyonlar için tarayın. Hala göğüs kafesi tutarken, kalp ve akciğerlere erişmek için ventral göğüs kafesi kesip ve akciğerlerin altında kesmek için kalp çekin.
Kalp ve akciğerleri tamamen çıkarmak için tüm ön kan damarlarını kesip trakea. Akciğer dokusuna veya akciğer metastatik lezyonlarına zarar vermeden kalbi pbs kabına dikkatlice aktarın. Prostat tümörü diseksiyon için bir diseksiyon mikroskobu altında ürogenital bölge yerleştirin.
Ürogenital bölgeyi sırt yüzeyine çevirmek için bir çift düz forceps ve bir çift kavisli forceps kullanın. Üretranın pembe-kırmızı rengi ile tanımlanabilecek proksimal prostat bölgesini bulun. Eğri forceps ile ürogenital dokunun manipülasyon izin vermek için üretra sıkıca tutun.
Onların dikkatli kaldırılmasına izin vermek için seminal veziküllerin tabanını bulun. Sonra vas deferens ve mümkün olduğunca çok yağlı ve bağ dokusu kaldırmak için çalgılar kavisli tarafı kullanın. Hala sıkıca üretra ve proksimal prostat bölgesi tutarken, üretra dan mesane kaldırmak için ince sivri makas bir çift kullanın.
Proksimal prostat bölgesini ve üretrayı düz çalgılarla sıkıca tutarak ön prostat bölgesini, keterlerin kavisli tarafıyla sıkıca tutarak dokuyu mesaneden ve prostatın geri kalanından sıkıca çeker. Ön prostat dokusunu PBS'ye yerleştirin ve ventral prostat bölgesini bulun. Ventral prostat bölgesini de aynı şekilde çıkarın.
Lateral bölge dorsal bölgeden ayırt edilebilir ise her iki tarafta lateral prostat bölgesi ni çıkarın. Daha sonra dorsal prostat bölgesini çıkarın ve proksimal prostat bölgesini %4 paraformaldehite yerleştirin. Kıyma sonra, 37 santigrat derece bir buçuk-iki saat sindirim için sindirim tampon 15 mililitrelik tüp içine tümör parçaları yerleştirin.
Sindirim sonunda, santrifüj ile sindirilmiş doku tortu ve supernatant atın. Hücre peletini gevşetmek için tüpü hafifçe kaydırın. Önceden ısıtılmış tripsin bir mililitre hücreleri resuspend 10 mikromolar Y-27632 ROCK inhibitörü ile takviye 37 santigrat derece beş dakika.
Kuluçka sonunda standart bir P1000 pipet ucu ile doku bulamaç beş kez triturate. Ek bir beş dakika kuluçka ve trituration için su banyosu için tüp dönün. Matris kubbe kaplama için soğuk ortamda dokuz mililitre sindirilmiş hücreleri yıkayın, sonra santrifüj ile hücreleri toplamak.
Saymak için taze orta bir mililitre hücreleri resuspend. Ve sayma sonra, bir kez daha santrifüj ile hücreleri toplamak. Tümör hücrelerini uygun matris hacminde seyreltin.
Dikkatle 55 derece santigrat her kuyuiçine matris hücre çözeltisi 200 mikrolitre damla altı kuyu plaka ısıtılır. Kubbelerin oda sıcaklığında iki dakika katılaşmasına izin verin ve tabağı 37 derecelik bir kuluçka makinesine 20 dakika baş aşağı yerleştirin. Kubbeler tamamen katılaşmış zaman her kuyuya androjen R1881 ve ROCK inhibitörü ile takviye prostat organoid orta iki mililitre ekleyin.
Plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine geri ver. Floresan diseksiyon görüntüleri, katı prostat tümörleri tarafından yeşil floresan protein veya GFP ekspresyonu ortaya, tümör hücrelerinin Cre ifade gösteren. Aynı hayvanın karaciğer ve akciğerleri, bu tümörlerin primer prostat tümöründen kaynaklandığını gösteren GFP'yi ifade eden metastatik tümörler sergilemektadır.
Bu fareden pelvik lenf düğümü GFP değil, Domates ifade eder, Bu metastatik tümör lenf düğümü geçti ve normal doku kalır belirten. Katı prostat tümöründen üretilen küçük organoidler kültürün ilk gününde tümör organoid kültüründe bulunan domates ve GFP ifade eden hücrelerle oluşmaya başlar. Yedinci gün ve ötesinde prostat tümör organoidleri tam olarak oluşmuş ancak, organoidler GFP ifade, ama Domates değil, organoidler Cre-ifade tümör hücrelerinden değil, normal epitel hücrelerinden kaynaklandığını düşündürmektedir.
Sıvı dolu prostat tümöründen üretilen küçük organoidlerin kültürünün birinci gününde hem Domates hem de GFP ifade eden hücreler organoid kültürü içinde mevcuttur. Sıvı dolu prostat tümörlerinden organoidler yedinci gün ve ötesinde GFP veya Domates ifade, organoidler Cre ifade etmez hücrelerden oluşan belirten. Prostat dokusuhasalırken odaklı kalmak için, mesane ve üretra pozisyonları her zaman farkında olun.
Organoidler kendi nesilden sonra görüntüleme uygulamalarında, moleküler biyoloji analizinde ve ilaç ekranlarında kullanılabilir.
