Bu tekniğin genel amacı, gen ekspresyonu manipülasyonlarının in vivo kortikal nöronal mimari üzerindeki etkisinin değerlendirilmesidir. Bu işlemin nötr bir elektroporasyona dayalı olanlara göre ilk önemli avantajımız gen ekspresyonu seviyelerinin ince kontrolüdür. Özellikle, bu entegre boru hattı defektin in vivo değerlendirmesini sağlar, nöronal sitomimari kontrolü gen ekspresyonundaki küçük değişiklikler ile yüceltilir.
Ayrıca, transplantasyon testinin çift yapısı istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için gerekli hayvan sayılarında büyük bir azalmaya olanak sağlar. Bu teknik, Tau EGFP transgenik embriyolarından kaynaklanan bir öncül havuzdan yararlanır. Bu havuz alternatif iki lentiviral karışımları ile enfekte iki alt havuzlar ayrılmıştır.
Yeşil bir test havuzu ve birlikte enjekte edilecek sarı bir kontrol havuzu elde etmek için. In vitro genişleme iki gün sonra, ortaya çıkan nöro küreler kesilir, bire bir karışık, ve fare ventriküler uzayda bir kılcal enjekte. On gün sonra, koronal kesitlerde immünororesans test ve kontrol nöronları arasında karşılaştırma sağlamak için yapılır.
Son olarak, immünosülbölümler morfometrik parametrelerin nihai değerlendirilmesi için görüntülenir ve iskeletlenir. In vivo transplantasyon dan önce, öncülü yeşil havuzu hazırlayın. E12.5 embriyolar, hamile bir baraj daha önce bir Tau EGFP kurucusu için çiftleştirilmiş hasat, PBS çözüm çok kuyulu plaka bireysel kuyularda ayarlanır.
Mavi ışık lambası altında görsel muayene ile hızlı bir şekilde genotip leyin. Parçalanmış yeşil korteksleri tek hücrelerle ayırın. Hücreleri proliferatif ortamda yeniden askıya alın ve eşit büyüklükteiki alt havuza bölün.
Her alt havuza özel bir lentiviral karışım bulaştırın. Her karışım kırmızı etiket virüsü veya siyah kontrol virüsü içerir. Yanı sıra Tet-Off tahrikli transgen veya kontrol ifadesi için virüsler, sırasıyla.
Her lentivirus 8 enfeksiyon çokluğu uygulanmalıdır. Plaka doksisiklin mililitre başına 2 mikrogram ile proliferatif ortamda enfekte hücreleri. Hücreleri kuvöze aktarın ve 37 derecede 2 gün bekletin.
2 gün sonra, iki alt havuzları küçük nörosferlerin süspansiyonlar olarak görünmelidir. Kırmızı floresan proteini homojen bir şekilde ifade ediyor ya da ifade etmiyor. Öncüllerin mühendislik sonra, P0 beyaz laboratuvar yavruları transplantasyon için bir değerlendirme dizisi ayarlayın.
Sırasıyla 1,5 milimetre ve 1,12 milimetreye eşit ebedi ve iç çapı olan borosilikat cam kılcal damarları kullanın. P1000 çekmecesi ile kılcal damarı çekin. İlk olarak, çekme programına girin.
İkincisi, tutucular içine kılcal yerleştirin ve onları sıkın. Üçüncü olarak, programı başlatmak ve iki çekti mikrocapiller almak. 200-250 mikrometre harici çapı ile bir ipucu elde etmek için stereomikroskop altında, bir neşter ile elle, kılcal ucu kesin.
Son olarak, kapalı bir Petri kabında plastik destek üzerine kılcal damarları yerleştirin ve kaputun altına aktarın. Optik lifleri dezenfekte edin ve kaputun altına yerleştirin. EGTA ve Fast Green ana karışımları karıştırın, hücre izleyici çözeltisi hazırlamak için, ve kaputun altına tekrar yerleştirin.
Hücre süspansiyon tespit için laboratuvar sızdırmazlık filmi küçük parçalar kesin. Ve son olarak, bir 0.3 mililitre şırınga atılır mililitre steril doksisiklin başına 1 miligram bir çözüm hazırlamak. Enjeksiyon tüpü iki lateks tüpten hazırlanır.
Bir lateks tüp bir ucuna sert bir plastik ağız parçası sabit. Daha sonra, diğer lateks tüpbir ucuna kapiller tutucu düzeltmek. Operatör mikroplara karşı bir bariyer olarak, 0,45 mikrometre steril filtreden iki lateks tüpün serbest uçlarını bağlayın.
Ortaya çıkan aspiratör tüp montajını kaputun altında tutulacak plastik bir tutucuüzerine yerleştirin. Nörosferleri ayrı tüplerde toplayın, test edin ve kontrol edin. Santrifüj nörosfer süspansiyonlar ve PBS tarafından supernatant değiştirin.
Bu sırayı iki kez daha tekrarlayın. Santrifüj nörosfer süspansiyonlar, tripsin çözeltisi ile supernatant değiştirin, ve pipet hücre pelet yukarı ve aşağı, 4, 5 kez. Tek bir hücre süspansiyonu almak için hücreleri beş dakika kuvözde bırakın.
Tripsin inhibitörü çözeltisi ile trypsin'i bloke edin. Santrifüj hücreleri, ve taze proliferatif ortamda onları yeniden askıya. İki havuzun hücrelerini sayın ve konsantrasyonlarını proliferatif ortamda mikrolitre başına 100,000 hücreye ayarlayın.
Daha sonra, test ve kontrol hücreleri 1:1 karıştırın ve bir floresan mikroskop altında ortaya çıkan karışımı kontrol edin. Son olarak, kaputun altında buz üzerinde karışımı yerleştirin. Anne ve yavrular ile birlikte kafesi cerrahi operatörlük alanından uzaktaki bir masada hazırlayın.
Bir kurtarma kafesi bir sepet e yerleştirin. Annenin kafesinden alınan talaş karışımını dibine koyun ve iyileşme kafesini bir lambanın altına yerleştirin. Kenara, P0 yavruların anestezi için alüminyum folyo ile kaplı bir buz kutusu ayarlayın.
Transplantasyondan hemen önce, bir hücre süspansiyonuna 1 ila 10 hacimlik bir hücre izleyici çözeltisi ekleyin ve ortaya çıkan karışımın üç mikrolitresini laboratuvar sızdırmazlık filminin üzerinde noktalayın. Bir dakika için serin, alüminyum folyo üzerinde yavru yerleştirin ve tamamen anestezi olup olmadığını kontrol edin. Bu arada, cam kılcal içine enjeksiyon karışımı 3 mikrolitre aspire.
% 70 etanol ile anestezip başını nazikçe silin. Sonra, kortikal yarımküreyi net bir şekilde tanımlamak için optik fiberüzerinde bulun. Ön içine kılcal girin ve ventriküler kavite erişin.
Bunu yaparken, kan damarlarına zarar vermemeye dikkat edin. Ganglionik saygınlık zarar görmesini önlemek için, otuz derece yanal iğne döndürün. Hücreleri yavaşça kaviteye enjekte edin ve Fast Green ile difüzyonlarını izleyin.
5-10 saniye bekleyin. Hücre süspansiyonuna aspire etmemeye dikkat edin ve uygun bir bertaraf kutusuna atın. Anesteziden yavru iyileşmeden önce, transgenik ekspresyonu nakilden sonra kapalı tutmak için intraperitoneal olarak 150 mikrolitre doksi çözeltisi enjekte edin.
Enjeksiyondan sonra, iyileşme için hemen lamba altında yavru yerleştirin. Yavruları 5-10 dakika orada bırakın ve tamamen uyandıklarında, onları annesiyle birlikte kafese koyun. Annenin onları kabul etmesini sağlamak için, 2-3 saat boyunca ameliyat edilen yavruları gözlemleyin.
Transgenik ifadeyi korumak için kafese 0,5 mg/mL doksisiklin ve sakaroz içeren içme suyu temin edin. Su içeren doksisiklini, nakilden dört gün sonra doksisitsiz su ile değiştirin. Böylece postmitotik nöronlarda trans-gen aktive.
Fareleri altı gün boyunca doksizsiz bir rejimde tutun ve P10'da ötenazi yap. Bir gecede 4 derece, 4 derece, pfa ötanazi yavrubeyinleri düzeltmek. PFA çözeltisini çıkarın ve %30 sakaroz çözeltisi ile değiştirin.
Şişenin dibine batana kadar beyni dört derecede bırak. Beyinleri, kriyo-dahil etme ortamıyla dolu tek kullanımlık bir katıştırma kalıbına aktarın. Dahil olan beyni 80 derecede dondurun.
Bir kriyostat kullanarak 60 mikron kalınlığında koronal kesitler kesin. Anti-GFP, anti-RFP immünoresans için proses bölümleri ve DAPI çözeltisi ile karşı leke. Konfokal mikroskobun çalışma parametrelerini gösterildiği gibi uygun şekilde ayarlayın.
RFP sinyal dağılımı kör GFP pozitif nöron açısından zengin fotoğraf alanları seçerek, immünoassayed dilimlerin resimlerini toplamak. Görüntüleri ND2 dosyaları olarak dışa aktarın ve bunların en fazla z-projeksiyonlarını TIFF dosyaları olarak oluşturun. Sonraki nöron iskeletleşme hücre genotip kör izin vermek için, kırmızı sinyal gizlemek.
Bunu yapmak için bir ayarlama katmanı ekleyin. Düzeyleri seçin, kırmızı seçin. Çıkışı sıfıra ayarlayın.
Ve dosyayı bu şekilde kaydedin. İskeletleştirme daha sonra orijinal düz kırmızı dosyalara daha önce erişimi olmayan yeni bir işleç tarafından gerçekleştirilir. Gizli her kırmızı dosya için dosyayı açın, birincil görüntüye bir çizim katmanı ekleyin ve kalem aracını seçin.
GFP sinyalitemelinde somer'ı takip edin. Sonra, nöritlerin izini sür. Son olarak, nöronal siluetler de dahil olmak üzere mutlilayer dosyasını kaydedin.
Nöronal iskeletlerin sonraki analizi her iki operatör tarafından da yapılabilir. Her mulitlayer dosyayı açın, siyah arka plan ile yeni boş 16 bit gri tonlama dosyaları oluşturun. Nöron başına bir tane.
Birincil görüntüden gri tonlan dosyalara tek nöronal siluetleri kopyalayın ve yapıştırın. Çok katmanlı dosyaya geri alın ve nöronal genotipleri ortaya çıkarmak için ayarlama katmanını kapatın. 16 bit gri tonlama dosyalarını kaydedin ve ilgili nöron genotiplerine açıklama ekleyin.
ImageJ'de gri tonlama görüntüleri tek tek içe aktarın ve Iskeletleri NeurphologyJ eklentisi ile analiz edin. Seçili NeurophologyJ birincil verilerini, toplam neurite uzunluğu alanını, ek noktalarını ve bitiş noktalarını bir elektronik tabloya toplayın ve ikincil morfometrik parametreleri hesaplamak için bunları çalıştırın. Önerdiğimiz mühendislik protokolü, araştırmaya tabi olan nöronların büyük çoğunluğunu amaçlanan transgen kümeleriyle bir araya getirmek için izin veriyor.
Ayrıca, transjene hücre popülasyonu içinde transgen ekspresyon düzeylerinin önemli bir homojenliği elde etmek için izin verir. İşlemimizin en önemli özelliği, eşleştirilmiş konfigürasyondur. Bir test ve kontrol öncül havuzu ayrı olarak tasarlanır, 1:1 karıştırılır ve son olarak birlikte nakledilir.
Bu eşleştirilmiş yaklaşım, özellikle farklı genotiplerle bağlantılı sonuç farklılıklarının saptanmasını kolaylaştıracaktır. Bu örnekte, foxg1 aşırı ifade nöron öncülleri ve kontrol olanları interventriküler co-enjeksiyon on gün sonra, nakledilen yavru koronal bölümleri analiz. Konfokal mikroskopi ile nöron gruplarının görüntüleri alındı.
Maksimum projeksiyonları hesaplamak için Z yığını dosyaları kullanıldı. Nöronal siluetler elle takip edildi. Burada, yeşil ve sarı siluetler Foxg1 aşırı ifade ve kontrol nöronları temsil, sırasıyla.
Son olarak, NeurphologyJ analizi ile elde edilen primer parametreler, gösterildiği gibi ikincil morfometrik endekslerin hesaplanmasında kullanılmıştır. Bu araştırmacı belirli bir genin karışık ifade, in vivo nötrit gelişimi darth ince kontrol üzerinde uygulayabilir etkisini değerlendirmek için izin veren basit bir protokoldür. Bu protokolün temel avantajları ikidir.
Nöronal morfogenezde yer alan mevcut gen sayısı, buna karşılık gelen teratojenik çizgilerin yokluğunda fonksiyonel olarak in vivo olarak karakterize edilebilir. Ve analiz için daha az hayvan önemli istatistiksel sonuçlar elde etmek için gereklidir.
