Bu yöntem, kromatin in 3Boyutlu yapısının gen ekspresyonunu ve gelişimini nasıl etkileyebileceği gibi kromatin mimarisi alanındaki anahtar soruların yanıtlatmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı kromatin mimarisinin yüksek çözünürlüklü bir görünüm ve tam olarak sahnelenen sinek embriyoları sağlar. Bu yöntem kromatin organizasyonu ve gelişimi hakkında bilgi sağlasa da, transgenik sinek kütüphanelerinden gelen mevcut hatları kromatin organizasyonundaki etkilerini test etmek için de kullanabilirsiniz.
Protokolü başlatmak için, daha önce toplanan embriyoların toplam hacmini PBST ile iki mililitreye ayarlayın. Suda altı mililitre heptane ve 100 mikrolitre %37 formaldehit ekleyin. Formaldehit ekledikten sonra, şiddetle bir dakika boyunca tüp yukarı ve aşağı sallayın.
Sulu ve organik faz bir şampuan gibi tutarlılık oluşturmak için birleştirir. Karışımı bir döner mikserde 10 dakika çalkalayın. Tüpün alt kısmında embriyo toplamak için oda sıcaklığında bir dakika için 500 kez g tüpü santrifüj.
Tüm şampuan benzeri sıvı aspire ve herhangi bir embriyo aspire değil dikkat alarak, atın. Formaldehit eklenmesinden 15 dakika sonra, 125 milimoler glisin ile PBST beş mililitre embriyolar resuspend. Bir dakika boyunca embriyoları şiddetle aşağı yukarı sallayın.
Santrifüjden sonra, supernatant aspire. 1,000 mikrolitrelik pipet kullanarak, 100 embriyodan oluşan bir toplu işlemi sıralamaiçin uygun küçük bir cam kapa aktarın, tercihen koyu bir arka plan üzerine yerleştirin ve buzun üzerine yerleştirin. Bir iğne veya şırınga ucu kullanarak nükleer yoğunluk ve hücre döngüsü durumuna göre sıralamak embriyolar.
EGFP PCNA ve kısmen nükleer olmayan GFP sinyali gösteren embriyoların dağınık, nükleer olmayan dağılımlarıyla tanınan tüm mitotik embriyoları çıkarın. Sıralamaya yardımcı olmak için, her bir toplu işlemde 12, 13 ve 14 numaralı nükleer döngülerde referans embriyoları sıraya dizerek embriyoları referans embriyolardan biriyle eşleştirin. 1,000 mikrolitrelik pipet kullanarak istenilen embriyoları yükseltin.
Onları taze bir tüpe aktarın ve buza yerleştirin. Planlanan deney için yeterli embriyo sıralanana kadar devam edin. Oda sıcaklığında 100 kez g kısa bir süre tüpler spin.
Supernatant çıkarın ve embriyolar donma için mümkün olduğunca kuru olduğundan emin olun. Flaş dondurma embriyolar sıvı azot tüpleri batırarak ve eksi 80 santigrat derece de saklayın. Dondurulmuş embriyolu tüpleri buza yerleştirin.
500 mikrolitre buz soğuk lisis tamponundaki embriyoları yeniden askıya alın. Embriyotüp altında yerleşmek için izin vermek için bir dakika bekleyin. Daha sonra, 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne sıkıca sığacak şekilde tasarlanmış buz üzerinde önceden soğutulmuş metal mikro havanele ile embriyoları öğütün.
Embriyoların ajitasyonunu önlemek için, tüpün dibine değene kadar zararlımaddeyi yavaşça takın. Aşağı itin ve sonra her iki yönde iki kez pestle döndürerek eziyet. Havaneleri çok hafifçe kaldırın.
Tüpün dibine tekrar itin ve taşlama işlemini 10 kez veya embriyolar tamamen lysed olana kadar tekrarlayın. Çözelti homojen olmalı ve embriyoların hiçbir kalıntı büyük parçaları kalmalıdır. Homojenize süspansiyonu 15 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırın.
1,000 kez g dört santigrat derece beş dakika spin. Supernatant atın ve 500 mikrolitre likis soğuk lysis tampon ve yukarı ve aşağı borulama resuspend tarafından pelet yıkayın. Başka bir spin sonra, supernatant atın.
Yıkanmış peleti %0,5 Sodyum Dodecyl Sülfat veya SDS'nin 100 mikrolitresinde yeniden askıya alın. Daha sonra bir ısıtma bloğunda 65 santigrat derece 10 dakika boyunca örnek kuluçka tarafından çekirdekleri geçirin. %10 Triton X100 50 mikrolitre ve 120 mikrolitre su ekleyin.
İçeriği karıştırmak için tüpü hafifçe uçurun ve tüpü bir ısı bloğunda 15 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. 10X restriksiyon enzim tampon 25 mikrolitre ve mikrolitre MBO1 başına beş birim 20 birim ekleyin. İçeriği karıştırmak için tüpü hareket ettirin ve DNA'yı sindirmek için tüpü Bir ısı bloğuna yerleştirin.
20 adet Daha MBO1 ekleyin. Kuluçkaya 90 dakika devam edin. İkinci 90 dakikalık kuluçkadan sonra, mbo1'i etkisiz katmak için numuneyi 62 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, 0.4 milimolar biotin 14-dATP 18 mikrolitre, değiştirilmemiş bir 3.3 milimolar dCTP-dGTP-dTTP karışımı 2.25 mikrolitre ve mikrolitre DNA polimeraz I Klenow parçası başına beş birim sekiz mikrolitre ekleyin. İçeriği karıştırmak için tüpü hafifçe vurun ve numuneyi 90 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Sonra, su 657 mikrolitre ekleyin, 10X T4 DNA ligaz tampon 120 mikrolitre, 100 mikrolitre 100 mikrolitre 10% Triton X100, mililitre başına 20 miligram altı mikrolitre sığır serum albumin, ve son olarak mikrolitre Başına beş mikrolitre T4 DNA ligaz.
Daha sonra, iki saat oda sıcaklığında 20 RPM yavaşça tüp döndürün. Mikrolitre Başına beş birim lik başka bir beş mikrolitre daha ekleyin T4 DNA ligaz. İki saat daha dönmeye devam edin, ardından çekirdekleri 2,500 kez beş dakika boyunca aşağı doğru döndürün.
Santrifüjden sonra, supernatant atın. Ekstraksiyon tampon 500 mikrolitre pelet resuspend ve mililitre proteinaz K.Flick tüp başına 20 mililitre 20 mikrolitre ekleyin ve protein sindirmek için tüp inkübün. De-crosslink için beş azı lı sodyum klorür ve tüpuv bir gecede 130 mikrolitre ekleyin.
Ertesi gün, pipet düşük DNA bağlama özellikleri ile yeni bir iki mililitretüp içine örnek. Üç azı lı sodyum asetat ve mililitre GlikoBlue başına 15 miligram iki mikrolitre 0.1X hacim ekleyin. 1,6 cilt saf mutlak etanol ekleyin ve içeriğini tersine çevirin, ardından numuneyi eksi 80 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, içindekileri santrifüj edin. Sadece GlycoBlue tarafından tespit edilebilir DNA pelet bulun. Pipet ucunu DNA peletinden karşı duvar boyunca tüpe taşıyarak supernatant'ı dikkatlice çıkarın.
Peleti %70 etanolün 800 mikrolitresiyle yıkayın. Beş dakika oda sıcaklığında 20,000 kez g olarak ters çevirerek ve santrifüj tarafından karıştırın. Bu adımda kalan damlacıkları çıkarın ve aşağıdaki bir P10 ucu ile tüpler dışarı iterek yıkar, sonra beş dakika kadar kuru hava kapağı nı açın.
Sıvı kaldıktan sonra, 10 milimolar tris klorür 50 mikrolitre ekleyin. Tekrar tekrar pelet DNA'yı yatıştırmak için bulunduğu alan üzerinde çözüm pipet. Tüpü hareket ettirerek mililitre RNase A.Mix başına 20 miligram lık bir mikrolitre ekleyin.
RNA'yı sindirmek için numuneyi 37 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. Son olarak, kütüphane hazırlanmasıkadar dondurucu veya buzdolabında örnek saklayın. Her sıralanmış embriyo toplu EGFP PCNA sinyal görüntüleri downstream deneyler için her bir embriyo nun kesin sahne ve hücre döngüsü durumlarını ortaya koymaktadır.
Biyoanalizör izleri, boyut seçiminden sonra DNA parçalarının boyut dağılımının 300 ila 700 baz çifti arasında olduğunu ve maksimum 450 baz çiftinin olduğunu göstermektedir. Hi-C etkileşim haritaları, nükleer döngü 12'de, az sayıda Topolojik İlişkili Etki Alanı veya TAD'nin tespit edildiğine ve taD'lerin giderek daha belirgin hale geldiğinde ve belirsiz uzun menzilli temaslar tükendiğinde 13 ve 14'lü nükleer döngülerde önemli ölçüde değişiklikler tespit edildiğini göstermektedir. Bu prosedürü çalışırken, boncukları iyice yıkamayı ve düşük kaliteli Hi-C kütüphanelerine yol açabileceğinden, özellikle yüksek sıcaklıklarda kuluçka sürelerini gereksiz yere uzatmamayı unutmamak önemlidir.
Doğru evreleme ve yüksek çözünürlüklü kromatin onay haritalama birleştiren bu teknik, epigenetik alanında araştırmacılar ın in vivo gelişim ortamında üç boyutlu kromatin organizasyonunun rolünü keşfetmelerinin önünü açmıştır.
