Multipleks floresan immünohistokimya birden fazla hücre tipini ve konumlarını bozulmamış formalin-sabit parafin gömülü dokuda tanımlar, bu da sadece hücre tanımlaması için değil, hücreden hücremekansal analize de olanak sağlar. Bu manuel tekniğin en büyük avantajı çapraz reaktivite olmadan aynı türün birden fazla antikor kullanımıdır. Bu teknik tümör mikroortamında bağışıklık ve kanser hücrelerinin etkileşimleri içine derinlemesine bir görünüm sağlar.
Bu tekniği ilk kez denerken, yaklaşık 3-4 gün boyama ya da işlem sırasında her adımı tamamen takip edin. Boyama işlemi ve multipleks tasarımı nın daha zayıf bir yöntemi, yaygın ve beklenen tuzakları azaltmak için çok önemlidir. Slaytları ayırarak ve yeniden sudinerek başlayın.
Doku yan ile hibridizasyon fırında onları lay ve bir saat boyunca 60 derece santigrat onları pişirin. Slaytları fırından alın ve dikey bir kaydırakta 5 ila 10 dakika soğumasını bekleyin. Daha sonra slaytları üç kez ksilen ve bir kez %100 etanol, %95 etanol ve %70 etanol ile 10'şar dakika boyunca tedavi etmek için bir slayt boyama seti kullanın.
Slaytrafını deiyonize suyla yıkayın ve daha sonra 30 dakika boyunca nötr arabelleğe aldanarak slaytları düzeltin. İki dakika su ile slaytlar yıkayın ve antijen alma ile devam edin. Slayt rafını pH 6.0 veya pH 9.0 antijen alma tamponu yla dolu ısıya dayanıklı bir kutuya yerleştirin.
Kutunun üzerini plastik ambalajla kapatın ve lastik bantla sabitleyin. Kutuyu dönen plakanın kenarına bir inverter donanımlı mikrodalgaya yerleştirin ve slaytları %100 güçte 45 saniye ısıtın ve ardından %20 güçte 15 dakika. Slaytlar microwaving sonra 15-20 dakika soğumasını bekleyin.
Bu arada, antikorlar ve floroforların çalışma çözümlerini hazırlayın. TBST veya 1X PBS 50 mililitre sığır serum albumen granül0 0,5 gram eriterek birincil antikor dilüent hazırlayın. Her birincil antikor çalışma çözeltisini önceden belirlenmiş bir konsantrasyona seyreltin.
Florofor seyreltici her florofor seyreltmek bir ila 100 konsantrasyonda. Boyama nın son gününde, bir mililitre TBST'ye üç damla DAPI ekleyerek DAPI çalışma çözümünü hazırlayın. Slaytlar soğuduktan sonra mikrodalgadan çıkarın ve plastik ambalajı çıkarın.
İki dakika deiyonize su ile yıkayın ve ardından TBST ile iki dakikalık bir yıkama. Yıkamadan sonra, hassas bir görev sil ve hidrofobik bariyer kalem ile doku dışında iz ile doku etrafında slayt kuru, doku dokunmamaya dikkat veya kurumasını bekleyin. Her slaytı nemlendirici haznesine yerleştirin ve dokuya yaklaşık dört damla bloklama çözeltisi ekleyin.
Daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca slaytlar kuluçka ve birincil antikor uygulaması ile devam edin. Kağıt havlu yığınının üzerindeki slaydın yan tarafına dokunarak her slayttan engelleme çözümünün çıkarılmasını ve kalan çözümü kaldırmak için hassas bir görev silme kullanın. Kaydırağı nemlendirilmiş odaya geri yerleştirin, çalışan birincil antikor yaklaşık 200 mikrolitre ekleyin ve bir saat kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, slaytları tbst'ye iki dakika boyunca batırarak üç kez yıkayın. Her slayttan kalan TBST kapalı Dab ve ikincil antikor yaklaşık üç ila dört damla uygulayın. 10 dakika boyunca nemlendirilmiş odada slaytlar kuluçka.
Slaytları TBST ile tekrar yıkayın ve florofor çalışma çözeltisinin yaklaşık 100 mikrolitresini uygulayın. Slaytları nemli odaya geri verin ve 10 dakika kuluçkaya yatırın. TBST yıkama tekrarlayın ve daha sonra antikorları kaldırmak için el yazması yönergelerine göre slaytlar mikrodalga.
Bu çok günlük boyama işlemi sırasında hatırlanması gereken önemli bir şey microwaving adım sonra durdurma ve antijen alma tampon gecede slaytlar bırakarak, doku ve leke bütünlüğünü sağlamak. Antijen alma solüsyonu ile son antikor uygulamasını çıkarın ve kayma başına iki dakika boyunca TBST ardından deiyonize su ile slaytları yıkayın. Antikor flurophore çiftleri geri kalanı için boyama adımları tekrarlayın ve sonra DAPI uygulaması ile devam edin.
Her slayta yaklaşık 150 mikrolitre çalışan DAPI çözeltisi uygulayın ve nemli haznede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, slaytları TBST ile yaklaşık 30 saniye yıkayın ve kapak fişlerini monte edin. Montaj ortamı kuruduktan sonra, emniyete almak için kapağın dört köşesine açık tırnak cilası uygulayın.
Monopleksi analiz etmek için, mikroskoptaki slaytları, odaklanmak için DAPI kullanarak 250 milisaniyelik pozlama ile görüntüleyin. Lekeli işaretleyicinin floresan yoğunluğuna bakarak her monopleks slaytı değerlendirin ve bu yoğunluğu arka planla karşılaştırın. Lekeli işaretçi yoğunluğu arka plandan en az beş kat daha yüksekse son multipleksteki slayt konumunu kullanın.
Multipleks boyama, her antikor için uygun sırayı seçin ve bir antikor için her florofor atayın. Daha önce açıklandığı gibi multipleks boyama ile devam edin ve primer antikor, florofor veya DAPI yerine antikor dilüent, florofor dilüent ve TBST alır boş bir slayt hazırlamak. Mikroskopüzerindeki çoklayıcıyı görüntülenmeye hazır olduğunuzda, pozlamayı tüm kanallar için 250 milisaniyeye ayarlayın ve odaklanmak için DAPI kullanarak her görüntüyü yakalayın.
Daha sonra her çokluk floresan yanlış renk ve patoloji görünümü ile her belirteç özgüllüğünü teyit edecek değerlendirmek için analiz yazılımı kullanın. Multipleks testin inbaşarısını sağlamak için, her antikor un sırasını belirlemek için monopleks bir test yapılmalıdır. Örneğin, Foxp3 dizinin üçüncü konumundayken, CD3 ile spesifik ve sağlam boyama ve kolokalizasyon gösterilmiştir.
Buna karşılık, Foxp3 ilk konumda olduğunda, Foxp3 nonspesifik boyama oluşur. Kaydırakların çoğunda kırmızının grenli ve verimli alanları bulunur ve bu alanların floresan yoğunluğu düşüktür. Bu tahlilde bir diğer önemli adım hücre tanımlama ve daha fazla analiz için temel olan DEPI karşı boyama vardır.
Çalışma ve çalışmayan DAPI ile görüntüler arasında net bir kontrast görülebilir. Multipleks tarar için, güzel kompozit görüntüler her zaman doğru bir leke yansıtmaz. CD3 görselleştirilmiş ve spesifik boyama gösterirken, CD163'ün patoloji parlak alan görünümü antikorun spesifik olmadığını kanıtlamaktadır.
Optimal multipleks görüntü kompozit görüntüde belirli boyama gösterir ve CD3 ve CD163 özgüllüğü patoloji brightfield görünümü ile doğrulanır. Bu yordamı takiben hücre ile hücre etkileşimlerini daha fazla analiz etmek için kendi kendini fenotipleme ve mekansal analiz hesaplamaları yapılabilir. Bu teknik, araştırmacıların hücrelerin ve bozulmamış dokunun mekansal desenlerini keşfetmelerinin önünü açarak tümör immün mikroçevresini daha iyi anlamamızı sağladı.
