Bu yöntem, hedefli immünomodülasyon için onkolitik vektörlerin gelişimini kolaylaştırarak kanser immünoterapisi alanındaki temel zorlukların giderilmesine yardımcı olabilir. Uygulanan ters genetik sistemin en büyük avantajı çok yönlülüğüdür;bu nedenle vektörler çeşitli araştırma sorularını ve çeşitli immün iyonlara sahip tümörleri hedef alacak şekilde uyarlanabilir. Virüs yayılma adımları özellikle virüs hasat için en uygun zaman noktası belirleyen bir metin protokolü öğrenmek zordur çünkü syncytia oluşumu zaman içinde görsel olarak değerlendirilmelidir.
El yazmasında açıklandığı gibi rekombinant immünomodülatör vektörleri tasarlamaya ve klonlamaya başlamak için. Bu protokol, bir onkolitik kızamık aşısı vektörü gelişimi için belirli adımları açıklar, bir bispesifik T hücre engager kodlama. Kızamık virüslerini cDNA'dan kurtarmak için, transfeksiyon plakasından 24 saat önce kızamık virüsü üreticisi hücreleri 6 duvar plakasında eşit olarak.
Tohum 200, 000 hücre 2 mililitre DMEM iyi başına yüzde 10 FBS içeren transfeksiyon sırasında yüzde 65-75 birleşme elde etmek. Hücreleri transfect için kullanılacak kızamık virüsü antigenomkodlama rekombinant DNA 5 mikrogram karıştırın. Uygun plazmidler ve toplam 200 mikrolitre DMEM hacminde floresan muhabir.
Karışıma 18,6 mikrolitre lipozomal transfeksiyon reaktifi ekleyin ve hemen tüpü karıştırın. Bu transfection karışımını oda sıcaklığında 25 dakika kuluçkaya yatırın. MV üretici hücreleri transfect için 6 iyi plaka 65-75 yüzde birleşimi için yetiştirilen orta kaldırmak ve iyi başına mililitre Kanamisin başına yüzde 2 FBS ve 50 mikrogram ile DMEM 1.8 mililitre ekleyin.
Sonra her iyi ve dikkatle girdap için dropwise transfection karışımı ekleyin. Hücreleri bir gecede 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Ertesi gün orta 2 mililitre taze DMEM ile yüzde 2 FBS ve mililitre Kanamisin başına 50 mikrogram değiştirin ve orta sarı renk tarafından tanınan asidik olduğunda bunu tekrarlayın.
Muhabir gen ekspresyonu ve senyiti oluşumu için hücreleri günlük gözlemlemek için bir mikroskop kullanın. 20 veya daha fazla hücreden oluşan büyük sintia görünür olduğunda veya hücreler çok yoğun hale geldiğinde virüs hasat. 24 saat önce beklenen hasat tohumu yaklaşık 1.5 milyon MV üretici hücreleri 12 mililitre DMEM ile 10 santimetre lik yemeklerde yüzde 10 FBS ile virüs aşılama sırasında yüzde 65-75 biraraya ulaşmak için.
Virüs progyny toplamak için dikkatle transfected hücreleri ile 6 duvar plakasından yapışık üretici hücreleri kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Kazınmış hücreleri içeren ortamı bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücre enkazkaldırmak için 5 dakika için en az 2500 kez G ve 4 derece santigrat için santrifüj.
Santrifüjden sonra hücresiz süpernatant ile serumsuz orta ile inokül hazırlamak için 4 mililitrelik son bir hacim de karıştırın. MV üretici hücreleri ile 10 santimetre lik çanak tan orta çıkarın ve hücrelere inoculum ekleyin. 37 santigrat derece ve yüzde 5 karbondioksit en az 2 saat kuluçka.
Kuluçka dan sonra bir gecede yüzde 10 FBS ve kuluçka hücreleri ile 6 mililitre DMEM ekleyin. Daha sonra 12 mililitre taze DMEM ile orta yı değiştirin ve yüzde 10 FBS ve 37 santigrat derece ve hasat kadar yüzde 5 karbondioksit inkübat. Hücreleri günde en az iki kez gözlemleyin.
Membran bozulması görünür hasat virüs haline geldiğinde senyiti patlamadan önce. Hasat için ilk pasaj plaka supernatant kaldırmak ve serum serbest orta 600 mikrolitre ekleyin. Sonra hücreleri kazımak ve temiz bir tüp e aktarmak için bir hücre kaldırıcı kullanın.
Bundan hemen sonra sıvı nitrojen virüs süspansiyon dondurma ve en az 24 saat boyunca 80 santigrat derecede saklayın iyice donma sağlamak için. 96 duvar plakaları kullanarak aliquot başına octuplicates virüs stoklarının titrelerini belirlemek için. Önce T75 hücre kültüründeki üretici hücrelerini 50 mililitrelik konik tüpe çekin.
Hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunu DMEM'de mililitre başına yüzde 10 FBS ile 150,000 hücreye ayarlayın. 96 duvar plakası kuyusu başına yüzde 10 FBS ile 90 mikrolitre DMEM ekleyin. Daha sonra plakanın ilk sütunundaki 8 kuyuya virüs stokunun bir aliquot'undan 10 mikrolitre ekleyin.
En az 10 kez yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak iyice karıştırın. Her kuyunun 10 mikrolitresini birinci sütundan ikinci sütuna aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak iyice karıştırın. Her seyreltme adımı için taze pipet ipuçları kullanarak virüsün seri on kat seyreltme elde etmek için her sütun için bu tekrarlayın.
Son sütunun her kuyudan 10 mikrolitre atın. Her iyi hiçbir hücre kümeleri olduğundan emin olmak için mililitre başına 150, 000 hücre ile hücre süspansiyon 100 mikrolitre ekleyin. 37 derecede kuluçka, 48 saat boyunca %5 karbondioksit.
Işık mikroskobu kullanarak syncytia olup yok. Görünür syncytia içeren en yüksek seyreltme faktörü ile sütunun her kuyuda sayma syncytia. Floresan muhabiri kodlayan virüsler için, syncytia floresan mikroskopisi kullanılarak sayılabilir.
Kızamık virüsü çoğaltma kinetiğinin analizi için enfeksiyon tohumundan bir gün önce 100, 1 mililitre DMEM'de 000 vero hücre ile 12 duvar plakasında yüzde 10 FBS ile ilgi nin her zaman için en az 2 kuyu vardır. Hücreleri enfekte etmek için virüsün ilgili miktarda içeren serum serbest orta 300 mikrolitre ile orta değiştirin. En az 2 saat boyunca 37 santigrat derecede ve yüzde 5 karbondioksitle kuluçkaya yat.
İnoculumu çıkarın ve yüzde 10 FBS ile 1 mililitre DMEM ekleyin ve kuluçkaya devam edin. Enfeksiyon hasat viral progyny sonra ilgili zaman noktalarında doğrudan orta içine hücreleri kazıyarak. İçeriği her kuyudan ayrı bir tüpe aktarın.
Sıvı nitrojende tonulayın ve titrasyona kadar 80 derecede saklayın ve el yazmasında açıklandığı gibi devam edin. LDH salınımı ile BTE indüklenen hücre aracılı sitotoksisite değerlendirilmesi başlamak için, ilk virüs enfekte hedef hücreleri tarafından ifade edilen gizli transgen ürünleri izole ve makalede açıklandığı gibi bağışıklık efektörü hücreleri izole. Daha sonra u-alt 96 duvar plakası tohum hedef hücreleri ve el yazması açıklandığı gibi örnekleri içerir.
Daha önce izole edilmiş immünomodülatörleri istenilen konsantrasyonlarda ilgili numunelere ekleyin. İstenilen oranlarda bağışıklık sığınmacı hücreleri ekleyin ve kuyu başına 100 mikrolitre toplam hacmine orta ekleyin. 37 santigrat derece ve yüzde 5 karbondioksit istenilen daha önce belirlenen zaman dilimleri için kuluçka.
Numune toplamadan 45 dakika önce, T max numuneleri ve ilgili orta kontrolleri içeren kuyulara 10 mikrolitre 10X Lysis Solüsyonu ekleyin ve kuluçkaya devam edin. Hücreleri 250 kez G'de 4 dakika santrifüj edin. Her kuyudan 50 mikrolitre süpernatantı düz bir alt 96 duvar plakasının kuyularına aktarın ve hücreleri aktarmayın.
Üreticiye göre substrat çözeltisi hazırlandıktan sonra her kuyuya 50 mikrolitre ekleyin. 30 dakika boyunca karanlıkta veya T max örnekleri derin kırmızıya dönüşene kadar oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Kuluçka dan sonra her kuyuya 50 mikrolitre dur çözeltisi ekleyin.
4000 kez G 1 dakika santrifüj ve sonra hava kabarcıkları kaldırmak için içi boş bir iğne kullanın. Optik emiciliği 490 nanometre olarak ölçün ve el yazmasında açıklandığı gibi hesaplayın. Değiştirilmemiş ve BTE kodlama onkolitik kızamık virüsleri vero hücreleri üzerinde karşılaştırıldığında vektörlerin büyüme eğrileri ile aşılama sonra benzer görünür.
İnsan karsinoembriyonik antijeni ve MV reseptörleri CD46'yı inolasyon dan sonra ifade eden mc38 murine kolorektal karsinom hücrelerinde hücre canlılığı eğrileri, transgen kodlama virüsünün litik aktivitesinin minfir tümör hücre hattında geride kaldığını göstermektedir. Beş farklı seyreltmede BTE ile kuluçkaya yatan hedef antijen ekspreshücrelerinin akış sitometrisi, bte'nin hücreler tarafından konsantrasyona bağımlı bir şekilde bağlaştığını gösterdi. BTE ilişkili hücrelerin manyetik çekilmesinden sonra immünoblotta, BTE'leri hedeflemeyen hücreler kullanıldığında tespit edilebilir miktarda hücre bulunmadığını göstermiştir;oysa BTE örneklerini hedef alırken elüsyon fraksiyonunda bağlı hücreler mevcuttu.
BTE aracılı hedef antijen spesifik ve murine T hücrelerinin konsantrasyona bağlı sitotoksisitesi temsili LDH salınım tahlili ile gösterilir ve mevcut örnekte referans hücrelere göre mililitre başına 1 mikrogram nispeten yüksek BTE konsantrasyonu nda yüzde 15 spesifik hücre öldürme elde edildiğini göstermektedir. Bu yordamı çalışırken, enfeksiyonun ilerlemesini kontrol etmek için hücreleri düzenli olarak izlemek için hatırlamak önemlidir. Zayıflatılmış olsa rekombinant kızamık aşısı suşları özellikle immüno-bastırılmış bireyler için tehlikeli olabilir unutmayın.
Uygun biyo güvenlik prosedürlerini izleyerek maruz kalmaktan kaçının. Bu yöntemleri gerçekleştirmeden önce virüs lerle uğraşan bireyler aşılanmalıdır. Bu prosedürütaki viral ekspresyonun virüs etkileşimlerini ve terapötik etkilerini analiz etmek için daha fazla transgen ekspresyonu sağlanabilir.
Bu tekniklerin geliştirilmesi biyoterapi alanında araştırmacılar için çok sayıda tümörlü varlıklarda lokal ifade immünomodülatörlerin etkilerini keşfetmek için yol açmıştır;In Vitro, In Vivo, ve ayrıca klinik çalışmalarda.
