Bu protokol Arabidopsis çift döllenme belirli bir faktör katılımını değerlendirmek için bir yol sağlar. Döllenme durumu bir bakışta sperm çekirdeklerinin morfolojisi ile değerlendirilebilir, bu nedenle istatistiksel analiz için verilerin hızlı bir şekilde elde edilmesi mümkündür. Bu yöntem Arabidopsis'te döllenme fenotipinin değerlendirilmesine özgüdür.
Arabidopsis'te bile hala bilinmeyen döllenme düzenleyicileri vardır. Bu yöntem, gelecekteki bilinmeyen döllenme faktörlerinin fonksiyonel analizi için yararlı olacaktır. Ovules hızlı ve bozulmamış işleme beceri master için bu analizin başarısı için önemlidir.
Başlamak için, bir büyüme odasında 16 saatlik ışık ve sekiz saatlik karanlık döngüsü altında 22 santigrat derece Arabidopsis thaliana büyümek. Kes ve aksiller tomurcukları gelişimini teşvik etmek makas ile ilk geliştirilen çiçek sapı kaldırın. İlk sapı kestikten 2-3 hafta sonra bitki nin yüksekliğini ölçün.
Yüksekliği 25 santimetrenin üzerinde olan bitkiler, güçlü bir şekilde büyüyen bitkiler olarak kabul edilir ve analiz için uygundur. Emasculate için, üst te görülen yaprakları bit ile evre 11 tomurcukları arayın. Sepal, yaprakları ve çiçek tomurcukları stamen kaldırmak için bir numara beş forceps kullanın.
Emasculation sonra 15 ila 18 saat, forceps ile filament pinching tarafından evre 13 HTR10-mRFP çiçek arka plan ile bir DMP9-knockdown hattının stamen almak. Tozlaşmak için, hafifçe bir dehiscent anther ile bir hadım pistil birkaç kez stigma pat. Tozlaşmadan 7-8 saat sonra pistil'i toplayın ve çift taraflı bandın üzerine yerleştirin.
Daha sonra, banttaki pisti düzeltmek için forceps ile hafifçe bastırın. Bir diseksiyon mikroskop altında, bir enjeksiyon iğnesi kullanarak yumurtalık üst ve alt uçları kesti. Enjeksiyon iğnesinin ucunu hareket ettirin ve yumurtalık duvarını replum'un her iki tarafı boyunca yarık için hareket ettirin.
Funiculus ve iletim yollarını ayırmamak için dikkatlice kesin. Evert yumurtalık duvarı. Ovules bağlı olduğu septum tabanı çimdik ve forseps ile dikkatlice yukarı kaldırın.
Bir slayt cam üzerinde su damlası içine ovules aktarın ve yavaşça bir floresan mikroskop altında gözlem için bir coverglass ile kaplayın. Floresan filtre küpü ile donatılmış bir epifloresan mikroskobunda objektif lensi 20x veya 40x olarak ayarlayın. mRFP ile etiketlenmiş sperm çekirdekleri içeren ovules görüntüleri elde edin.
Bir embriyo kesesinde mRFP etiketli sperm çekirdeklerinin sayısını doğrulayın. Bir embriyo kesesinde mRFP etiketli her sperm çekirdeğinin şeklini ve konumunu doğrulayın. Bu çalışmada, ovule sperm nükleer sinyal morfolojisi ile döllenme fenotipleri değerlendirildi.
Ovulların çoğunda yumurta hücresi mikropylar tarafında ve merkezi hücreli charazal uç tarafında iki adet yoğuşmalı mRFP etiketli sperm çekirdeği bulunurdu. Bu başarılı çift döllenme gösterir. Buna ek olarak, merkezi hücre çekirdeğinde dekontosi mRFP etiketli sperm çekirdeği ve yumurta hücresi dışında yoğunlaştırılmış mRFP etiketli sperm çekirdeği içeren ovulesler gözlendi ve bu da tek bir döllenme yi gösteriyordu.
Çift döllenmenin başarısız olması durumunda yumurta hücresi ve merkezi hücre sınırında iki adet yoğuşmalı mRFP etiketli sperm çekirdeği gözlendi. HTR10-mRFP polen arka plan ile DMP9-knockdown hattı kullanılarak yapılan analizde, tek bir yoğunlaştırılmış mRFP etiketli sperm çekirdeği veya üç veya daha fazla mRFP etiketli sperm çekirdeği içeren ovules nadiren gözlendi. Kadın marker hatlarının kullanımı ile birleştirerek daha doğru döllenme durumu analiz edilebilir.
Örneğin, gamet füzyon sonra ve karyogami önce döllenme durumu değerlendirilebilir. Evet, döllenme işlemi birkaç adıma ayrılmıştır. Her döllenme regülatörü hangi adımları bu geliştirilmiş yöntem ile cevaplanabilir dahil sorular.
Bu bitkinin eşeyli üreme içine daha derin bir fikir sağlayacaktır.
