Bu teknik, canlı görüntüleme mikroskopisi kullanılarak oosit nükleer göçü gibi parçalanmış Drosophila yumurta odalarında uzun biyolojik süreçleri gözlemlemeyi mümkün kılar. Bu protokol, canlı görüntüleme mikroskopisi yapmak için parçalanmış yumurta odalarının 12 saat boyunca nasıl canlı tutulamayacağını açıklar. Başlamak için, pipet 200 mikrolitre Schneider Medium ve mililitre insülin başına 10 miligram 30 mikrolitre ile takviye, sonra ısı inaktive fetal baldır serum dört mikrolitre ekleyin.
Delinmiş slaydın alt tarafındaki deliğin etrafına az miktarda silikon gres uygulamak için pipet ucu kullanın. Bir kapak kılıfı yerleştirin ve kaydırağa silikon halka iç kısım oluşturmak için silikon gresi düzleştirmek için kapak ucuna basınç uygulamak için pipet ucunun geniş ucunu kullanın. Uyuşturulduğu dişi sinekleri görüntüleme ortamının 150 mikrolitresini içeren diseksiyon kuyusuna aktarın.
Dişiyi kesmek için, toraksı kapmak ve dorsal karın manikülini ikinci bir çift forsepsle sıkıştırmak için forseps kullanın. Uterus, yumurta kanalı ve kas kılımını dikkatlice çıkarın. Manikür açıklığı sırasında görülebilen yumurtalık çiftini izole edin ve ayırın.
Görüntüleme ortamının 10 ila 15 mikrolitresini yumurtalıklara yerleştirin ve bir yumurtalığı görüntüleme odasına aktarın. Yumurtalıkları ayırmak için, yumurtalığın arka ucunun tutulması için iğneyi kullanın. Yumurtalıkları ayırmak için germarium'ı dikkatlice çekmek için başka bir iğne kullanın.
Kılıfi bir iğneyle tutun ve yumurta odalarında kalan kas kılıfi çıkarmak için yumurtalığı başka bir iğneyle daha büyük odalardan çekin. Duyulmamış yumurta boylarının batmasına ve kapakla temas etmesine izin verin. Geç aşamaları ve yumurtalıkların geri kalanınıps kullanarak mikro şarampolden çıkarın.
Kazanımı kolaylaştırmak için yumurtalıkları dikkatlice uzaklaştırmak için iğneler kullanın. Geçirgen zarın 10 milimetre karesine küçük bir 10 kesin. Herhangi bir hava kabarcığı çıkarmak için membranı görüntüleme ortamının üstüne dikkatlice uygulayın.
Daha sonra odayı membran konturu üzerindeki kuyunun etrafında ince bir halokarbon yağı tabakası ile hermetik olarak kapatın. Görüntüleme kurulumunu ters mikroskobun slayt tutucusuna yerleştirin ve 40X hedefi kullanın. Yabani tip yumurta odasının oosit çekirdeğinin göçü canlı görüntüleme mikroskopisi kullanılarak yakalandı.
Çekirdek, iki plazma zarının kesişimindeki son konumuna ulaşmak için yörüngeler boyunca kaymadan önce ön plazma zarı veya lateral plazma zarı ile ulaşır. Membran deformiteleri, dağınık foliküler hücreler, bodur hücreler ve küçülmüş çekirdekler ölmekte olan yumurta odalarının ilk belirtileridir. Sekiz saatlik görüntülemeden önce dejenere olan oosit genellikle saptılmamıştır.
Bununla birlikte, nadir görülen erken dejenerasyon vakaları diseksiyon veya montaj adımları sırasındaki sorunlardan kaynaklanmaktadır. Yumurta odalarına zarar vermek hayatta kalmalarını tehlikeye atmaktadır. Bu yüzden hassas el hassas diseksiyonu ve mikro şarampole hazırlanması her şeyden önemlidir.
Bu prosedür, oosit çekirdeğinin göçü sırasında üç farklı yörünge alabileceğini ve farklı organellerin oosit içindeki bu yörüngeleri düzenlediğini görselleştirmemizi sağladı.
