Bu işlemlerin amacı, floresan mikroskopi veya akış sitometri analizi ile birlikte spesifik floresan problar kullanarak sperm zarlarının bütünlüğünü değerlendirmektir. Bu teknikler, üreme alanındaki temel soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir, örneğin döllenme potansiyelinin tahmini ve sperm numunesinin kalitesi gibi. Bu tekniklerin en büyük avantajı, sperm döllenme potansiyeli ile ilişkilendirdiği bilinen birden fazla sperm zarının hassas bir şekilde değerlendirilmesini sağlamaktır.
Bu tekniklerin etkileri, sperm plazması ve akrozom membran bütünlüğünün ve mitokondriyal membran potansiyelinin daha doğru değerlendirilmesini sağladığı için boşalma kalitesinin tanısına doğru uzanır. Bu prosedüre başlamak için, oda sıcaklığında 15 mililitrelik bir tüp içinde yaklaşık 1-6 mililitre boğa meni elde edin. Her bir mililitre meniye 37 santigrat dereceye önceden ısıtılmış altı mililitre NKM tampon ekleyin.
8 dakika boyunca 600 kez g santrifüj. Santrifüj, süpernatant temizolana kadar bir veya iki kez tekrarlayın. Bundan sonra, hemen pelet üzerinde supernatant yaklaşık bir santimetre bırakarak, supernatant en atın.
Tüpleri kuvözde 30 derecelik bir açıyla dikkatlice yaslayın ve spermatozoanın yüzmesini sağlamak için 20 ila 30 dakika bekleyin. Bir mikropipet kullanarak, dikkatle şimdi hareketli spermatozoa içeren supernatant kalan bir mililitre kaldırmak ve taze bir 1.5 mililitretüp aktarın. Kullanıma hazır olana kadar spermi 37 derecede tutun.
İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi gerekli tüm stok çözümlerini hazırlayın. Daha sonra, 133 mikrolitre hareketli spermatozoa mililitre başına 25 milyon sperm konsantrasyonu ile yeni bir 1.5 mililitretüp aktarın. DAPI çalışma çözeltisi 17 mikrolitre ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka.
Santrifüj 1,000 kez g beş dakika için. Supernatant atın ve pelet nkm tampon 100 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, 50 mikrolitre FITC-PSA, iki mikrolitre JC-1 ve üç mikrolitre PI ekleyin. 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yat.
Santrifüj 1,000 kez g beş dakika için. Supernatant atın ve NKM tampon 40 mikrolitre pelet resuspend. Daha sonra numunenin 10 mikrolitresini cam bir slayta aktarın.
Örneği smear ve bir coverslip ekleyin. Bundan sonra, her filtre için ayrı bir görüntü yakalamak için bir dijital kamera kullanarak, metin protokolünde belirtildiği gibi 40X objektif ve üçlü filtre ile epifloresan mikroskobu ile örneği görselleştirmeye hemen başlayın. Filtrelerden alınan üç görüntüyü birleştirmek ve yeni dosyayı JPEG biçiminde kaydetmek için kamera yazılımındaki birleştirme seçeneğini kullanın.
Birleştirilmiş görüntüyü boya aletiyle açın ve sayılan spermatozoayı işaretlemek için fırça seçeneğini kullanın. Daha sonra, spermatozoa'yı her probdan yayılan floresan göre sınıflandırın ve slayt başına en az 200 spermatozoa değerlendirin. Tüm hücreler DAPI'den mavi görünmelidir.
Canlılığı değerlendirmek için mor görünen ölü hücreleri sayın. Daha sonra akrozom durumunu değerlendirmek için floresan boyama desenleri kullanın. Son olarak, yeşil lekeli bir orta parçası sergileyen düşük mitokondriyal membran potansiyeline sahip spermatozoadan kırmızı lekeli bir orta parça sergileyen yüksek mitokondriyal membran potansiyeline sahip spermatozoayı ayırt ederek mitokondriyal membran potansiyelini değerlendirin.
Kırmızı ve yeşil midleri ayrı ayrı sayın ve oranlarını hesaplayın. Plazma membran bütünlüğü değerlendirmesine başlamak için, canlılık ve konsantrasyon kitinden istenilen sayıda kuyu alın. Kuyuları çalışma tabanına aktarın ve ışıktan korumak için onları esnek bir kapakla kapatın.
Her kuyuya sitometri için 199 mikrolitre arabellekli çözelti ekleyin. Daha sonra her kuyuya mililitre başına 57 milyon hücre konsantrasyonunda bir mikrolitre homojen meni ekleyin ve pipetleme ile homojenize edin. Kapağı kapağı ile kapak ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka.
Bundan sonra, canlılık ayarını kullanarak numuneyi akış sitometresi üzerinden çalıştırın. Mitokondriyal membran potansiyelini değerlendirmeye başlamak için mitokondriyal aktivite kitinden istenilen sayıda kuyu alın. Onları çalışma üssüne aktarın.
Her kuyuya 10 mikrolitre mutlak etanol ekleyin ve kuyunun içindeki tozu yeniden askıya almak için bir pipet kullanın. Kuyu başına 190 mikrolitre PBS ekleyin ve pipetleme ile homojenize. Her kuyuya mililitre başına 57 milyon hücre konsantrasyonunda 0,75 mikrolitre homojen meni ekleyin ve pipetleme ile homojenleştirin.
Kapağı kapağı ile kapak ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka. Bundan sonra, mitokondriyal aktivite ayarını kullanarak numuneyi akış sitometresinde çalıştırın. Akzonomal membran bütünlüğünü değerlendirmeye başlamak için, canlılık ve akrozom bütünlük kitinden istenilen sayıda kuyu çıkarın.
Kuyuları çalışma tabanına aktarın ve ışıktan korumak için onları esnek bir kapakla kapatın. Her kuyuya sitometri için 200 mikrolitre arabellekli çözelti ekleyin. Daha sonra her kuyuya mililitre başına 57 milyon hücre konsantrasyonunda 0,7 mikrolitre homojen meni ekleyin ve pipetleme ile homojenize edin.
Kapağı kapağı ile kapak ve 45 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka. Bundan sonra, içgörü ayarını kullanarak örneği akış sitometresi üzerinden çalıştırın. Bu çalışmada meni kalitesi farklı teknikler kullanılarak değerlendirilmekte olup, bunlardan biri florometrik problar kullanılarak sperm membranları değerlendirilmiştir.
Sperm numunesi kalitesindeki farklılıkları membran bütünlüğü açısından değerlendirmek mümkündür. Örneğin, yedi numaralı boğanın boşalması ölü hücrelerin nispeten düşük bir yüzdesine, psödo-tepkili akrozom ile sperm düşük bir oranda ve boğa bir numaralı boşalma ile karşılaştırıldığında daha yüksek mitokondriyal membran potansiyeli vardı. Örnekler daha sonra canlılık ve mitokondriyal aktivite açısından değerlendirilir.
Bu temsili örnekler için histogramlar ungated spermatozoa ve enkaz ve kapılı spermatozoa temsil eder. Bu histogramlar aynı zamanda canlı ve ölü hücreleri ve polarize ve polarize mitokondriyal membran spermatozoa dağılımını temsil eder. Daha sonra akrozom bütünlüğü kullanıma hazır bir kit ile değerlendirilir ve akış sitometrisi ile okunur, alanı, bozulmamış lekesiz akrozom, akrozomun artık lekeli kısmı olan düşük floresan hücreleri ve bozulmuş akrozomlu hücreleri ile ihmal edilebilir düşük floresan hücreleri temsil eden üç marker alana bölünür.
Bu prosedürleri çalışırken, doğru ilk sperm örneği hazırlamak için emin olmak önemlidir. Bu teknikler sperm kalitesi değerlendirmesi hakkında bilgi sağlayabilir ve büyükbaş, kümes hayvanları ve insan gibi çeşitli organizmalara uygulanabilir. Bu iki teknik arasında yapılan karşılaştırmada, dörtlü boyama ve akış sitometrisi canlılık, mitokondriyal membran potansiyeli ve akrozom bütünlüğü açısından anlamlı bir fark olmadığını göstermiştir.
