İki adımlı PCR ve Yeni Nesil 16S rRNA Gen Sıralaması Kullanarak Mikrobiyota Analizi

Mikrobiyom profilleme sağlık ve hastalık mikrobiyom rolünü tanımlama ya doğru ilk adımdır. Burada, dışkı örneğinden yüksek kaliteli bakteri DNA'sını izole etmek için basit bir prosedürü tanımlıyoruz, 16SR RNA ve meta genomik sıralama ve mikrobiyom veri analizi gerçekleştiriyoruz. Bu protokol, mikrobiyom alanında yeni araştırmacıların yanı sıra laboratuvarlarında mikrobiyom boru hattını kurmada mikrobiyom alanında çalışan araştırmacılara yardımcı olacaktır. Bu protokol, hayvan ve insan deneklerin burun, oral veya deri örnekleri gibi diğer biyoörneklerden mikrobiyom profilleme için uzatılabilir. Tüm downstream adımlar yüksek kaliteli DNA bağlıdır gibi boncuk toplama en önemli adımlardır. Koruma plakasının uygun şekilde sızdırmazlığı önemlidir, çünkü eksik sızdırmazlık, güçlendirilmiş ürünün baskılanmasına yol açarak düşük kaliteli sıralama verilerine yol açabilir. Başlamak için,% 70 etanol ile bölücü kutuları sterilize. Sterilize bölücü kutuları fareler yerleştirin ve onları bir saate kadar normal dışkı sağlar. Boş bir önceden etiketli 1.5 mililitre mikro santrifüj tüp dışkı pelet toplamak için steril forceps kullanın. Tüpü güvenli bir şekilde içine tonuyla tonuyla tolun. Her fareden dışkı topladıktan sonra forsepsleri %70 etanol ile sterilize edin, ardından mikrop öldürücü tek kullanımlık mendil. 0,1 mililitrelik cam boncuklarla 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne 200 miligram dışkı peletağırlığında olun ve boncuk tüpünü homogenizer'i yenen bir boncuk içine yerleştirin ve numuneleri saniyede 4,5 metre hızla oda sıcaklığında 45 saniye homojenize edin. 1,5 mililitrelik mikro santimetreperfüj tüp kiti üreticisi ve elute DNA talimatları na göre DNA ayıklayın. DNA'yı izole ettikten sonra, bir florometreye 1 mikrolitre DNA yükleyerek izole edilmiş DNA'yı ölçün. Kurulum 16S ribozomal RNA gen amplifikasyonu PCR1 96-Well PCR plaka, 25 mikrolitre reaksiyon hacmi kullanarak. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 40 nano gram DNA, 13,5 mikro litre 2X yüksek kaliteli polimeraz enzim karışımı, tampon içeren, artı ileri ve ters astar DNTPs ekleyin. PCR plakayı dört kenar boyunca yukarıdan aşağıya doğru düzgün bir şekilde kapatın. Ve santrifüj 1000 kez G 20