Development of the method presented here has been carried out with various sources of funding, including Genome Canada and Genome Quebec, Environment Canada STAGE program and internal NRC funds.

Füzyon Yöntemi ile 1. 16S rRNA gen Amplikon Kütüphane Hazırlık <ol><li> 5&#39;- SKK CTC:;, ters R533-IonP1 5&#39;- CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 &#39;: primerler (İleri, F343-Iona-MIDXX eritin Bir TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 &#39;AT TAT GGG CAG TCG GTG; kalın: İyon Torrent özel adaptörler; italik:; normal yazı tipi sıralama çalışmasının başında sinyal yoğunluğu kalibre için sıralama anahtarı: template-spesifik primerler; X ... X: 10 bp barkod, bazı barkod dizileri için bakınız Tablo 1), 2x HotStartTaq Artı usta karışımı ve örnekleri. Hafifçe karıştırılmalıdır ana karışımı hariç, kullanmadan önce iyice karıştırınız. </li><li> Ters primer 0.5 uM, 0.4 mg / büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve 1x HotStartTaq ve master karışımı ml bir PCR karışımı (20 ul reaksiyonları) hazırlayın. E ana karışımı 18.5 ul ekleyinach PCR tüp. </li><li> Birlikte dizildi edilecek numunelerin her biri için farklı bir barkod olan bir ileri primer (20 mM, 0.5 ul) eklenir. PCR tüpü, numune 1 ul (1-10 ng / ml) eklenir. </li><li> PCR makine tüpleri yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;de ilk denatürasyon; 30 saniye için 95 ° C 25 döngü, 30 saniye boyunca 55 ° C, 45 saniye için 72 ° C; &#39; 10 dakika boyunca 72 ° C&#39;de son uzatma. PCR ürünleri 4 ° CO tutulur / N veya kullanılıncaya kadar donmuş olabilir. </li></ol> 2. Amplikon Arıtma, Sayımı ve havuzu <ol><li> En tarak olarak temin edilebilen bir% 2 agaroz jeli hazırlayın. De boş her numune ayrılması jel üzerinde reaksiyonu ve yük 6x jel yükleme boyası 5 ul ekleyin. 50 dakika boyunca 70 V jel çalıştırın. </li><li> Jel resim çekin ve bantları kesti (250 bp etrafında beklenen boyutu: 190 bp ürünü artı 63 bp adaptörleri ve barkod) temiz bir neşter kullanılarak. </li><li&gt; kesilmiş bantları tartılır ve (söz gelimi, QIAquick jel ekstre etme kiti) PCR ürünlerinin jel ekstraksiyonu ve saflaştırılması devam edin. </li><li> PicoGreen her bir PCR ürünü sayısal olarak 5 x 10 9 molekül / ul (yaklaşık 1 ng / ul) ile bir stok çözeltisi elde etmek için dilüsyonları yapmak. Bazı örnekler düşük büyütme göstermek isterseniz, sonraki işlemler için uygun en düşük konsantrasyon 1,57 x 10 7 moleküller / ul (26 pM) olduğunu akılda tutarak, daha düşük bir konsantrasyonda dilüsyonlarını ayarlayın. </li><li> Her bir seyreltilmiş PCR ürünü Havuzu 10 ul numune eşmolar bir havuz elde etmek için. Planlanan sıralama seferin her biri için bir ayrı bir havuz hazırlayın. Kullanılana kadar bir araya getirilmiş PCR ürünleri, dondurucuda saklanabilir. </li></ol> 3. Emülsiyon PCR ve Sıralama <ol><li> Emülsiyon PCR gerçekleştirin: <ol><li> 25 ul bir hacim içinde 26 pM, havuzdan toplanan PCR ürünlerinin seyreltin. Ion PGM şablon kiti çözülme reaktifler. </li><li> PCR kaputu emülsiyon PCR karışımı (kitinde reaktifler) hazırlayın ve bankta toplanmış PCR ürünleri ve (verilen) küre parçacıkları ekleyin. İyice karıştırın ve bir filtre kartuş içinde karışımı yerleştirin ve dikkatli emülsiyon yağ ile top (sağlanan). </li><li> Yavaşça otomatik emülsiyon PCR cihazında (örneğin, İyon One Touch 2 alet) üzerine filtre kartuşunu ve yük ters. Uygun programı seçin ve prosedürü başlatın. </li></ol></li><li> PCR tamamlandıktan sonra otomatik emülsiyon, toplama tüpleri süpernatantı ve tüplerin alt küre parçacıkları almak. (Kitte sağlanan), yıkama çözeltisinin 100 ul küreler tekrar ve kütüphane miktar tayini için bir 2.0 ul tablet alın. </li><li> Kütüphane miktarının gerçekleştirin. <ol><li> SSPE tamponu (150 mM NaCI, 10 mM napo 4, 1 mM Na 2 -EDTA) Adaptör B&#39;-Fam 2 ul (5&#39;-FAM ile -CT 100 ul karıştırınG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 &#39;) prob ve Adaptör A-Cy5&#39;in 2 ul (5&#39;Cy5 -CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3&#39;) prob. Adım 3.2 &#39;de alınan 2.0 ul kana Bu karışımın 52 ul ekleyin ve miktar tayini için bir boşluk olarak kalan 52 ul (şablon kit) yıkama çözeltisi, 2 ul ekle. </li><li> 2 dakika için 37 ° C de, 2 dakika boyunca 95 ° C&#39;de inkübe edilir. 1.5 ml tüpler içindeki karışımları aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 15.500 x g&#39;de TEX tampon maddesi (10 mM Tris, 1 mM EDTA,% 0.01 Triton X-100, pH 8.0) içinde, 1.0 ml, ekleyin ve karıştırın santrifüj. Süpernatantı ve her tüp içinde 20 ul bırakın. Bu yıkama işlemi iki kez tekrarlanır. </li><li> TEX tampon 180 ul pelet tanecikleri yeniden sübyeleştirmek ve 500 ul Qubit tüplere aktarın. </li><li> Bir Qubit aparatı kullanılarak FAM ve Cy5 için floresan ölçmek ve İyon Topluluk web sitesinde bulunan hesap makinesi kullanarak olumlu kürelerin oranını hesaplamak. </li></ol></li><li> Otomatik zenginleştirme sistemi (örneğin, İyon One Touch Zenginleştirme Sistemi) kullanarak (amplifiye DNA içeren) pozitif küreler için küre parçacıkların kalan zenginleştirin. <ol><li> Sağlanan 8-iyi şeridinin uygun kuyularda Pipetleyin reaktifler: Peki 1: adım 3.2 &#39;den küre parçacıklar; 2 Peki: MyOne Streptavidin C1 boncuk (13 ul) önceden yıkanmış; De 3, 4 ve 5: yıkama çözeltisi (şablon kitte sağlanan); 6 Şey: boş; İyi 7: eriyik dışı çözeltisi (125 mM NaOH,% 0.1 Tween 20); Peki 8: boş. </li><li> Pipetleme kolunda bir ipucu ve numune toplanması için 0.2 ml tüp takın. Aleti başlatın. Zenginleştirme sonunda, çözelti (Resim) nötralize 10 ul ekle. Zenginleştirilmiş boncuk kadar 15 gün boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol></li><li> Sıralama cihazı başlatılamıyor: <ol><li> Sıralama çalıştırmak ayrıntılarını belirterek, sıralama cihaza bağlayın ve bir sıralama çalışma planı hazırlar. </li><li> InstalL. yıkama çözeltisi # 2 (iyon PGM dizileme kitte sağlanan), yıkama çözeltisi # 1 (350 ul 100 mM NaOH) ve oto-pH tampon çözeltisi (verilmiştir). </li><li> Başlatma prosedürü başlatın ve ne zaman kendi 50 ml&#39;lik tüplere dATP, dGTP ve dTTP&#39;nin dCTP nükleotidler (Resim) ekleyin istenir. Sıralama makine üzerine tüpler vida ve başlatma işlemi devam ediyor. Başlatma tamamlandığında, hemen çalışma prosedürü başlatmak. </li></ol></li><li> Sıralama için örnekleri hazırlayın ve yonga yüklemek: <ol><li> 1.5 dakika boyunca 15,500 x g&#39;de santrifüj ile tüpün altındaki adım 3.4 zengin küreler toplayın. Tam 3 ul bırakarak süpernatantı. </li><li> (Sıralama kitinde) dizileme primeri 3 ul ekleyin, parçacıkların tekrar süspansiyon aşağı yukarı pipetleme ile iyice karıştırın ve. 2 dakika için 37 ° C de, 2 dakika boyunca 95 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Polimeraz (sağlanan), iyice karıştırın ve inkubasyon 1 ul ekle5 dakika boyunca oda sıcaklığında yedi. 30 dakika içinde sekanslama çip üzerinde enzim karışımı küre yüklemek için devam edin. </li><li> İnkübasyon sırasında, dizileyiciye sıralama çip yüklemek ve bir çip kalite kontrolü gerçekleştirecek. Santrifüj ile çip sıvıyı çıkarın ve yavaşça enzim küre karışımı (7 ul) aşağı pipetleyerek ve yongada kabarcıklarının giriş kaçınarak çipte örnek yüklemek. </li><li> Bir mikrosantrfuj 1 dakika boyunca üç kez çipini santrifüjleyin. Her santrifüj de çip yönünü değiştirin ve pipetleme ve her vadede arasında aşağı karıştırın. </li><li> Enstrüman çip yükleyin ve çalışma başlatmak. </li></ol></li></ol> 4. Temel Dizi Veri Analizi <ol><li> Sıralama veri sunucusuna bağlanmak ve fastq dosyasını indirin. Astar ve barkod bilgileri (Tablo 1 örneğe bakın) içeren bir sekme ile sınırlandırılmış &quot;oligo&#39;lar&quot; dosyası oluşturun. Mot adlı greengenes referans dosyaları indirmekhur et ( <a href="http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline">http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline</a> ). </li><li> Mothur başlatın ve analizlerini gerçekleştirmek: <ol><li> Aşağıdaki komutu kullanarak bir FASTA için fastq dosyası ve kaliteli bir dosya dönüştürme: fastq.info (fastq = test.fastq) </li><li> Her dizinin grup üyeliğini belirlemek ve aşağıdaki komutu kullanarak dizileri Döşeme: trim.seqs (Fasta = test.fasta, oligolar = barcode.txt, qfile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, minLength = 150, keepforward = T), </li><li> Çeşitli seçenekler, arzu edilen sertlik göre değiştirilebilir </li><li> Aşağıdaki komutu kullanarak greengenes taksonomisinde diziler sınıflandırma: classify.seqs (Fasta = test.trim.fasta, yöntem = wang, grup = test.groups, şablon = gg_99_otus.fasta, taksonomi = gg_99_otus.tax, kesim = 50) </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Sipos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+PCR+biases+in+environmental+microbiology+studies.">Addressing PCR biases in environmental microbiology studies.</a> Methods Mol. Biol. 599, 37-58 (2010).</li><li>Schloss, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+effects+of+PCR+amplification+and+sequencing+artifacts+on+16S+rRNA-based+studies.">Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies.</a> PLoS ONE. 6, e27310 (2011).</li><li>Tringe, S. G., Hugenholtz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+renaissance+for+the+pioneering+16S+rRNA+gene.">A renaissance for the pioneering 16S rRNA gene.</a> Curr. Opin. Microbiol. 11, 442-446 (2008).</li><li>Margulies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+in+microfabricated+high-density+picolitre+reactors.">Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors.</a> Nature. 437, 376-380 (2005).</li><li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+community+resemblance+methods+differ+in+their+ability+to+detect+biologically+relevant+patterns.">Microbial community resemblance methods differ in their ability to detect biologically relevant patterns.</a> Nat. Methods. 7, 813-819 (2010).</li><li>Bondici, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+communities+in+low-permeability,+high+pH+uranium+mine+tailings:+characterization+and+potential+effects.">Microbial communities in low-permeability, high pH uranium mine tailings: characterization and potential effects.</a> J. Appl. Microbiol. 113, 1671-1686 (2013).</li><li>Auffret, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+water+quality+on+the+bacterial+populations+and+off-flavours+in+recirculating+aquaculture+systems.">Impact of water quality on the bacterial populations and off-flavours in recirculating aquaculture systems.</a> FEMS Microbiology Ecology. 84, 235-247 (2013).</li><li>Bell, T. H., Yergeau, E., Juck, D., Whyte, L. G., Greer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+microbial+community+structure+affects+diesel+biodegradation+in+an+Arctic+soil.">Alteration of microbial community structure affects diesel biodegradation in an Arctic soil.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 85, 51-61 (2013).</li><li>Bell, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+bacterial+composition+and+hydrocarbon+degradation+in+Arctic+soils+following+diesel+and+nutrient+disturbance.">Predictable bacterial composition and hydrocarbon degradation in Arctic soils following diesel and nutrient disturbance.</a> ISME J. 7, 1200-1210 (2013).</li><li>Yergeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+microbial+communities+in+the+Athabasca+River+and+its+tributaries+in+relation+to+oil+sands+mining+activities.">Next-generation sequencing of microbial communities in the Athabasca River and its tributaries in relation to oil sands mining activities.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 7626-7637 (2012).</li><li>Yergeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerobic+biofilms+grown+from+Athabasca+watershed+sediments+are+inhibited+by+increasing+bituminous+compounds+concentrations.">Aerobic biofilms grown from Athabasca watershed sediments are inhibited by increasing bituminous compounds concentrations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 7398-7412 (2013).</li><li>Yergeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+expression+profiles+in+the+rhizosphere+of+willows+depend+on+soil+contamination.">Microbial expression profiles in the rhizosphere of willows depend on soil contamination.</a> ISME J. 8, 344-358 (2013).</li><li>Deagle, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+sequence+proportions+in+a+DNA-based+diet+study+using+Ion+Torrent+amplicon+sequencing:+which+counts+count.">Quantifying sequence proportions in a DNA-based diet study using Ion Torrent amplicon sequencing: which counts count.</a> Mol. Ecol. Resour. 13, 620-633 (2013).</li><li>Milani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+fecal+microbiota:+an+optimized+Ion+Torrent+16S+rRNA+gene-based+analysis+protocol.">Assessing the fecal microbiota: an optimized Ion Torrent 16S rRNA gene-based analysis protocol.</a> PLoS ONE. 8, e68739 (2013).</li><li>J&#252;nemann, S., Prior, P., Szczepanowski, R., Harks, I., Ehmke, B., Goesmann, A., Stoye, J., Dag Harmsen, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+community+shift+in+treated+periodontitis+patients+revealed+by+Ion+Torrent+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing.">Bacterial community shift in treated periodontitis patients revealed by Ion Torrent 16S rRNA gene amplicon sequencing.</a> PLoS ONE. 7, e41606 (2012).</li><li>Petrof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stool+substitute+transplant+therapy+for+the+eradication+of+Clostridium+difficile+infection:+'RePOOPulating'+the+gut.">Stool substitute transplant therapy for the eradication of Clostridium difficile infection: 'RePOOPulating' the gut.</a> Microbiome. 1, 3 (2013).</li><li>Whiteley, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+16S+rRNA+Ion+Tag+and+community+metagenome+sequencing+using+the+Ion+Torrent+(PGM)+Platform.">Microbial 16S rRNA Ion Tag and community metagenome sequencing using the Ion Torrent (PGM) Platform.</a> J. Microbiol. Meth. 91, 80-88 (2012).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME J. 6, 1621-1624 (2012).</li><li>Kozich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-index+sequencing+strategy+and+curation+pipeline+for+analyzing+amplicon+sequence+data+on+the+MiSeq+Illumina+sequencing+platform.">Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 5112-5120 (2013).</li><li>Hamady, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+UniFrac:+facilitating+high-throughput+phylogenetic+analyses+of+microbial+communities+including+analysis+of+pyrosequencing+and+PhyloChip+data.">Fast UniFrac: facilitating high-throughput phylogenetic analyses of microbial communities including analysis of pyrosequencing and PhyloChip data.</a> ISME J. 4, 17-27 (2010).</li><li>Quince, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removing+noise+from+pyrosequenced+amplicons.">Removing noise from pyrosequenced amplicons.</a> BMC Bioinformatics. 12, 38 (2011).</li><li>Huse, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ironing+out+the+wrinkles+in+the+rare+biosphere+through+improved+OTU+clustering.">Ironing out the wrinkles in the rare biosphere through improved OTU clustering.</a> Environ. Microbiol. 12, 1889-1898 (2010).</li><li>Edwards, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+dynamics+of+initial+bacterial+colonization+of+nonconserved+forage+in+the+bovine+rumen.">Characterization of the dynamics of initial bacterial colonization of nonconserved forage in the bovine rumen.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 62, 323-335 (2007).</li><li>Rastogi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+toolbox+for+the+culture-independent+quantification+of+total+bacterial+abundances+in+plant+environments.">A PCR-based toolbox for the culture-independent quantification of total bacterial abundances in plant environments.</a> J. Microbiol. Methods. 83, 127-132 (2010).</li><li>Baker, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+and+re-analysis+of+domain-specific+16S+primers.">Review and re-analysis of domain-specific 16S primers.</a> J. Microbiol. Methods. 55, 541-555 (2003).</li><li>Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+alignment+quality,+distance+calculation+method,+sequence+filtering,+and+region+on+the+analysis+of+16S+rRNA+gene-based+studies.">The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000844 (2010).</li><li>Links, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperonin-60+universal+target+Is+a+barcode+for+bacteria+that+enables+de+novo+assembly+of+metagenomic+sequence+data.">The chaperonin-60 universal target Is a barcode for bacteria that enables de novo assembly of metagenomic sequence data.</a> PLoS ONE. 7, e49755 (2012).</li><li>Vos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+rpoB+and+16S+rRNA+as+markers+in+pyrosequencing+studies+of+bacterial+diversity.">Comparison of rpoB and 16S rRNA as markers in pyrosequencing studies of bacterial diversity.</a> PLoS ONE. 7, e30600 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Burada sunulan yöntem basit ve ucuz olduğunu ve birçok laboratuarlar metagenomic sıralama gücünü erişmek için izin vermelidir. , Kullanılan sekanslama platforma bağlı olarak değişmekle birlikte, bir kez kütüphaneler sürecinin en otomatize edilir çok az eller süresi gereklidir inşa edilir. Burada kullanılan sekanslama platformun (iyon sel PGM) için tam bir prosedür çalışma iki gün içinde gerçekleştirilebilir. PCR, 36 numune amplifikasyon: 36 örneklerinin 25 $, jel saflaştırma ve PicoGreen DNA kantitatif aşağıdaki gibidir: (Eylül 2013) yazma Şu anda, yukarıda ayrıntılı olarak örnek ile ilgili reaktif maliyetlerdi $ 125, bir emülsiyon PCR ile bir araya getirilmiş amplikonu numune için : $ 550 ya da numune başına 15 $ veya kalitesi filtreli okuma başına 0,0015 $ toplam 250 $, $ 150 ve sıralama reaktifler. Bu fiyat, enstrüman hizmeti sözleşmesi, enstrüman amortisman, teknisyen maaş ve laboratuvar alanı kullanımını içermez. örneklerin her biri için, okur çadır &quot;&gt; en önemli adımlardan biri, benzer sayıda almak üzere, eşit molar oranda tüm ürünleri havuzu etmektir. PicoGreen miktar burada kullanıldığı, fakat diğer yöntemler de, daha az hassas, uygun olabilir (örneğin, UV ölçümü, jel esaslı ölçüm). bile en doğru olarak gösterir ve havuzu yaparak, numune başına okur sayısında bir değişkenlik vardır ve Tablo 2&#39;de ayrıntıları verilen tipik bir çalışma süreci içinde, bir ikinci 4380 32750 arasında değişir 10.338 arasında bir ortalama okuma ile okur. örneği (40-50 daha fazla) çok sayıda işleme durumunda, tek bir sütun jeli ile arıtma bir katı boyut kesilmesi ile levha veya saflaştırma ile boncuk jel saflaştırma ile ikame edilebilir (örneğin, AMPure boncuk) . Bugüne kadar, 16S rRNA geni için en çok kullanılan yeni nesil dizileme teknolojisi, bu protokolde kullanılan 454. İyon Torrent sıralama teknolojisi kavramsal çok benzer olduğunu454 ve her iki teknoloji dizileme hataların aynı tür yatkındır. Şaşırtıcı değil Ion Torrent dizileme 454 dizileme 10 çok benzer sıralama sonuçlardan dolayı gösterilmiştir. Son zamanlarda, birçok araştırmacı 16S rRNA gen amplikonu dizileme 18,19 için Illumina teknoloji kullanımını araştırdı. Her durumda, bu yöntemde en son tarif edilen şekilde, bu sekans teknolojilerini için gerekli olan adaptörler ve barkod eşleştirmek için, füzyon primer dizileri değiştirerek Illumina MiSeq veya 454 GS Junior gibi diğer tezgah sequencer şu anki protokolünü adapte kolay olurdu Illumina MiSeq 19 için. Alternatif olarak, araştırmacılar adımları burada ayrıntılı protokolün 1 ve 2 takip ve emülsiyon PCR ve sıralama gerçekleştirilir olacağını bir sıralama merkezine toplanmış amplıkonları gönderebilir. 16S rRNA gen kesilmiş ve Mothur kullanarak sınıflandırılır, ama birçok diğer analizler yapılabilir edildi okur16S rRNA gen amplikonları. Örneğin, p çeşitlilik de ana hatları çizilen prosedür kullanılarak her numune çifti arasındaki mesafeleri hesaplamak Unifrac ile değerlendirilebilir <a href="http://unifrac.colorado.edu/">http://unifrac.colorado.edu/</a> 20. Alfa indeksler ve her bir numunenin işletme taksonomik birimlerinin sayısı AmpliconNoise 21 gibi QIIME olan araçlar kullanılarak ya da Mothur içinde Huse ve ark. 22 ve kullanılabilir tarafından ana hatları çizilen prosedür kullanılarak hesaplanabilir. Burada kullanılan primerler 16S rRNA geninin değişken bölgeler 3 ve 4, büyütülmüş, ancak bir çok diğer bölgeler hedeflenebilir. Bu çalışmada, 16S rRNA genleri bitki malzemesinden büyütülmüş ve primerin seçimi kloroplast 16S rRNA geninin 23,24 genleşmesini önlemek için yapıldı. Ürün uzunluğu, taksonomik güç ve kullanışlılık 25,26 vadede farklılık mevcut diğer primerler geniş bir çeşitlilik vardır. Bununla birlikte, tüm durumlarda 200-400 bp güvenilir tür düzeyinde sınıflandırılmış olamaz 16S rRNA geninin okur ve analizler cinsi ve daha yüksek taksonomik seviyelere sınırlıdır. Türler seviyesi bilgileri cpn60 ve rpoB genler 27,28 gibi, ihtiyaç duyulması halinde diğer genler daha uygun olabilir. Analitik araçların gücü, sıralama ve artar maliyet Gelecek köklü damlaları mümkün av tüfeği metagenomics tarafından 16S rRNA gen sıralamasını değiştirmek için yapmak olabilir, ama o zamana kadar 16S rRNA gen dizileme çevresel mikrobiyoloji altın standart olmaya devam etmektedir.

Çevresel bir numunesi içinde ihtiva edilen genetik bilgilerin tamamını hedef olarak metagenomic dizileme çok güçlü bir teknolojidir. Av tüfeği sıralama, büyük-insert kütüphaneler ve amplikon sıralama dahil metagenomic sıralamanın farklı tatlar vardır. Amplikon dizisi oluşturma genel olarak düzenlenebilir, bir tek genomik bölgeden göreceli olarak ucuz, hızlı ve okur üretmek mümkün olma avantajını sunmaktadır. Ayrıca, amplikonu sıralama için veri analizi iş akışı çoğunlukla standardize edilmiştir. Bu PCR dayalı olduğundan Ancak, tüm eksik özgüllük, eksik kapsam ve astar ile ilgili önyargıları en iyi yarı-kantitatif bu yaklaşımı yapar 1,2, eğilimlendireceği vardır. Birçok fonksiyonel bölgeleri genomik genler de dahil olmak üzere, amplikon, sıralama için hedef olabilir, ama en popüler seçenek bir topluluk profili oluşturmak amacıyla, örneğin, 16S rRNA geni gibi marker genleri olarak kullanım için vardır. Geleneksel olarak, 16S rRNA gen amplikon sequencing E&#39;de klonlama dahil emek yoğun teknikler kullanılarak gerçekleştirilmiştir E. coli, koloni toplama ve izole edilen plasmidler üzerindeki Sanger dizileme ile ekstraksiyon ve ardından plazmid, ve dolayısıyla, çalışmaların çoğu numune başına 100&#39;den daha az klon analiz edilmiştir. Yeni nesil dizileme iki önemli ilerlemeler getirdi: en önemlisi sıralama reaksiyonlar ve kitlesel paralelleştirmeyi şablonları klonal ayrılmasını bir dizi gen parçaları eklemek için gerek kalmadan. Bu son derece 16S rRNA dizilemesi 3 amplikonu için bir &quot;Renaissance&quot; ile sonuçlanan, hemen geri birçok çevresel Mikrobiyoloji çalışmaları rutin bir özellik olarak bir 16S rRNA gen amplikonların sıralama, basitleştirmiştir. 2005 4 Roche 454 dizileme gelişiyle bu yana, diğer birkaç nesil dizileme teknolojileri piyasaya çıktı (örn, Illumina, Katı, PacBio). Tezgah üstü dizisinin Daha yakın zamanda, girişrs küçük laboratuarlara büyük dizileme merkezlerine kez özel sıralama kapasitesini getirdi. Beş Benchtop makineleri mevcuttur: 454 GS Junior Ion Torrent Kişisel Genom Makinesi (PGM) ve Proton ve Illumina MiSeq ve NextSeq 500. tüm bu dizicilerini az sunan en YARIZAMANLI daha vadede ve dolar başına daha az baz başına okur ise ölçek sequencers, onlar hızlı, daha esnek ve düşük satın alma ve çalıştırma maliyetleri küçük akademik laboratuvarlar için onlara uygun hale getirir. Çalışmaların bu tip, genel olarak bir sekanslama derinliğine gerekli değildir, çünkü, özellikle de masa üstü sekanslayıcı çevresel Mikrobiyoloji çalışmalarda amplikon, küçük genomu ve düşük karmaşıklık metagenome sekanslaması için uygundur. Örneğin, genellikle 16S rRNA gen dizileme sayısını inceleyen için multi-milyon veri setlerini 5 okur gibi aynı desen üretebilirsiniz okur 1.000 ~ olarak, numune başına okur şeyden olmadığı kabul edilmektedir. Söyledikten, tezgah üstü sonraki generatio<html> n sequencers hala maksimal verimi ile dizi büyük miktarda veri oluşturmak ~ 35 Mbp (454 GS Yeni) ~ 2 Gbp (Ion Torrent PGM), ~ 10-15 Gbp (Ion Torrent Proton), ~ 10 Gbp (Illumina MiSeq) ve en çevre mikrobiyolojisi çalışmaları için daha yeterli ~ 100 Gbp (Illumina Sonraki Dizi 500),. Benchtop sekanslayıcılar kullanılarak 16S rRNA amplikonlarının nesil dizileme yakın ortamlarda çeşitli uygulanmıştır. Örneğin, İyon Torrent PGM toplum için kullanılır olmuştur petrol kumları madencilik etkilenen sedimanlar, hidrokarbon-kirlenmiş Arctic toprakların 8,9 yetiştiricilik sistemleri 7, devinimiyla, özellikle yüksek pH ve düşük geçirgenliği 6 vardı uranyum maden atıklarının analiz ve insan ve hayvan organlarının 13-16, kirlenmiş topraklarda 12 ekilen söğütler ve anaerobik çürütücü 17 rizosferde bir Athabasca Nehri 10,11 dan biyofilm. Bu katkı detaylı bir tezgah üstü nesil sequencer (Ion Torrent PGM) kullanarak evde 16S rRNA gen amplıkonları sıralamak bizim yaklaşım olarak jove_content &quot;&gt;. DNA izolasyonundan sonra, 16S rRNA genleri içeren etki alanı düzeyinde bakteriyel primerler kullanılarak yükseltildi edilir dizileme adaptörler ve benzersiz örnek özgü dizileri (barkod). Amplıkonlar eşit mol oranında, arıtılmış, miktarı ve bir araya getirilmiştir. Örnekler daha sonra bir araya getirilmiş klonal bir emülsiyon PCR ile amplifiye edilmiş ve sekans işlemi uygulanır. Elde edilen diziler (halka açık biyoenformatik aletleri kullanılarak analiz edilir örneğin, Mothur).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Reagent</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:128px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion 314 Chip Kit v2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4482261</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion PGM Sequencing 200 Kit v2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4482006</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion PGM Template OT2 200 Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4480974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq Plus Master Mix Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>203646</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primers and probes</td>
			<td style="width:145px;">IDT</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qiaquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA 20 mg/ml</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10,711,454,001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

next-generation sequencing of 16s ribosomal rna gene amplicons

Mikrobiyal ekolojide önemli sorulardan biri &quot;kim var?&quot; Olan bu soru çeşitli araçları kullanarak cevap, ancak uzun ömürlü altın standartlardan biri etki düzeyinde PCR tarafından oluşturulan 16S ribozomal RNA (rRNA) gen amplıkonları sıralamak için olabilir genomik DNA&#39;dan amplifiye reaksiyonları. Geleneksel olarak, bu klonlama ve Sanger (kapiler elektroforez) PCR amplikonlarının dizilemesi ile gerçekleştirilmiştir. Gelecek nesil dizileme gelişi müthiş basitleştirilmiş ve 16S rRNA gen sıralama için sıralama derinliği artmıştır. Benchtop sıralayıcıların tanıtımı şimdi küçük laboratuvarlar gün bir konuda in-house kendi 16S rRNA sıralamayı gerçekleştirmek için olanak sağlar. Burada, bir tezgah üstü nesil dizi kullanılarak, 16S rRNA gen amplikon dizileme için bir yaklaşım ayrıntılı olarak verilmiştir. Çevresel DNA dizi analizi ilk adaptör ve barkod içeren primerler kullanılarak PCR ile amplifiye edilir. Daha sonra emülsiyon, PCR yoluyla küresel parçacıklar kuple edilir. Parçacıklar l vardırBir tek çip üzerinde oaded ve çip dizisi yapıldı ve bundan sonra sıralama makinesi içinde eklenir. Sekanslar, fastq biçiminde alınır, filtre edilmiş ve barkod okur numune üyelik oluşturmak için kullanılır edilir. Daha sonra kamuya mevcut araçları kullanarak analiz edilir okur süzülür ve binned. Okur bir örnek analiz Mothur verilen yazılım paketi içinde bir sınıflandırma-bulma algoritması ile sınıflandırıldı. Burada özetlenen yöntem, basit, ucuz ve basittir ve devam eden genomik devrimden yararlanmak küçük laboratuarları yardımcı olmalıdır.

Jeli üzerinde saflaştırmadan sonra, PCR amplifikasyonu 25 döngü, amplifikasyon ürünleri, su 50 ul ng 0,2-10,0 bir konsantrasyonda genellikle. Bu, başlangıç ​​DNA&#39;sı konsantrasyonu, numune tipine ve kullanılan saflaştırma kiti bağlı olarak geniş ölçüde değişebilir. Tüm örnekler döngü aynı sayıda kullanımı ile amplifiye edilebilir olmalıdır göz önünde tutarak, kimera önlenmesi ve amplifikasyon yanlılığı azaltmak için mümkün olan en düşük PCR döngüsü sayısını tutulması tavsiye edilir. Poliklonal sayısını okur ve boş küreler en aza indirmek ve okuma sayısını en üst düzeye çıkarmak için, Qubit oranı, ortalama çıkış yaklaşık olarak 0.1 ile 0.3 ve FAM floresan bir iyon Torrent PGM bir 314 yongası ile 200 üzerinde olmalıdır arasında olmalıdır 36 multiplekslenmiş environ ihtiva eden bir çalışma için prosedürün her aşamasından sonra okur, 0.3-0.5 M iyi kalitede Mothur sonuçların, süzme işleminden sonra okur. Tablo 2 sayısı tipik bir dağılımını göstermektedirruhsal örnekleri primerler 16S V3-4 bölgeyi hedefleyebilir ve Mothur kullanılarak analiz ile amplifiye edilmiştir. Mothur yılında trim.seqs prosedür kalite filtreleri ve gerekçe ile birlikte kaliteli filtreleri geçemedi dizileri içeren bir &quot;* .scrap.fasta&quot; geçti dizileri içeren bir &quot;* .trim.fasta&quot; dosyası oluşturmak dizi başlığı ret. &quot;Oligolar&quot; dosyasında barkod ile birlikte, bu komut da barkod dizisine dayanan her sekansın grup üyeliğini içeren bir &quot;* fitilden&quot; dosyası oluşturur. Classify.seqs prosedür Excel&#39;de açılabilen bir &quot;.tax.summary&quot; oluşturur. Bu dosya (sütunlarda) örneklerin her biri için (satır) taksonomik bağlarının bir özetini içerir. Bu dosya aşağı istatistiksel analizler için kullanılabilir ve çeşitli taksonomik düzeylerde toplum kompozisyon görselleştirmek için. &quot;.taxonomy&quot; Dosyası ayrıntılı taksonomik içerirher dizisi için bağlı. 36 örneklerin genelinde filumudur / sınıf düzeyinde ortalama topluluk kompozisyonu Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51709/51709fig1highres.jpg" width="500" /> Tüm örneklerin genelinde filumudur / sınıf düzeyinde 1. Ortalama toplum kompozisyonu Şekil. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="248"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> ileri </td><td style="width:139px;"> TACGGRAGGCAGCAG </td><td style="width:47px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Barkod </td><td> CTAAGGTAAC </td><td> Sample01 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Barkod </td><td> TAAGGAGAAC </td><td> Sample02 </td></tr><tr height = &quot;20&quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;"> Barkod </td><td> AAGAGGATTC </td><td> Sample03 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Barkod </td><td> TACCAAGATC </td><td> Sample04 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Barkod </td><td> CAGAAGGAAC </td><td> Sample05 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Barkod </td><td> CTGCAAGTTC </td><td> Sample06 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Barkod </td><td> TTCGTGATTC </td><td> Sample07 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Barkod </td><td> TTCCGATAAC </td><td> Sample08 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Barkod </td><td> TGAGCGGAAC </td><td> Sample09 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Barkod </td><td> CTGACCGAAC </td><td> Sample10 </td></tr></tbody></table> Mothur kullanılmak üzere Tablo 1. Örnek &quot;oligo&#39;lar&quot; dosyası. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="660"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"></td><td style="width:67px;"> # Okur </td><td style="width:123px;"> Önceki aşamada% </td><td style="width:107px;"> Ort. Örnek başına </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Kuyu sayısı </td><td align="center"> 1262519 </td><td> - </td><td align="center"> 35,070 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Boncuklar ile kuyu </td><td align="center"> 1114108 </td><td align="center"> 88.20% </td><td align="center"> 30.947 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Şablonları ile Boncuk </td><td align="center"> 1112746 </td><td align="center"> 99.90% </td><td align="center"> 30,910 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Monoklonal boncuk </td><td align="center"> 826.805 </td><td align="center"> 74.30% </td><td align="center"> 22,967 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> İyi kalite okur (sequencer Çıktı) </td><td align="center"> 782.204 </td><td align="center"> 94.60% </td><td align="center"> 21,728 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Geçiş Mothur filtreler (Min. Ort. 50 baz puanlık bir pencere üzerinde 20 kalite puanı, Min. 150bp uzunluğu) </td><td align="center"> 372.168 </td><td align="center"> 47.60% </td><td align="center"> 10.338 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Greengenes yılında filumudur seviyede sınıflandırılan (% 50 güven eşiği) </td><td align="center"> 342.171 </td><td align="center"> 91.90% </td><td align="center"> 9,505 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Greengenes aile düzeyinde sınıflandırılan (% 50 güven eşiği) </td><td align="center"> 316.512 </td><td align="center"> 92.50% </td><td align="center"> 8.792 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Greengenes yılında cins düzeyinde sınıflandırılan (% 50 güven eşiği) </td><td align="center"> 289.899 </td><td align="center"> 91.60% </td><td align="center"> 8.053 </td></tr></tbody></table> Bir Ion Torrent 314 çip çoğullanmasıyla 36 çevresel örneklerde tipik bir çalışma üretilen okur Tablo 2. sayısı.

Watch this Scientific Journal Video about Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons at JoVE.com

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

16S Ribozomal RNA Gen amplikonlarının nesil Sıralama

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

next-generation-sequencing-of-16s-ribosomal-rna-gene-amplicons

Research

JoVE Journal

Biology

83.1K Görüntüleme.  National Research Council Canada. Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer. 

Video: Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Biyoloji

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

Sivrisinek Gut Metagenomic RNA-seq Ribozomal RNA tükenmesi

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

DNA Metilasyon Analizi nesil Dizilimine tarafından hedef

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Bakteriyel Topluluk Karakterizasyonu Verimli Nükleik Asit Ekstraksiyonu ve 16S rRNA gen Sıralama

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA Sıralama Deneyi Gen İfade ve Genomik değişiklikleri tanımlamak için hedeflenen

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

16S rRNA Amplicon sıralama tarafından dışkı mikrobiyal karakterizasyonu için rehberli iletişim kuralı

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

Kene Microbiome karakterizasyonu tarafından yeni nesil 16S rRNA Amplicon sıralama

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

İki adımlı PCR ve Yeni Nesil 16S rRNA Gen Sıralaması Kullanarak Mikrobiyota Analizi

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high quality and quantity DNA from a well-preserved individual mosquito sufficient for downstream whole genome sequencing. However, reliance on an expensive automated DNA extraction instrument can be prohibitive for many laboratories. Here, the study provides a budget-friendly magnetic-bead-based DNA extraction protocol, which is suitable for low to medium throughput. The protocol described here was successfully tested using individual Aedes aegypti mosquito samples. The reduced costs associated with high quality DNA extraction will increase the application of high throughput sequencing to resource limited labs and studies.

Described here is a DNA extraction protocol using magnetic beads to produce high quality DNA extractions from mosquitoes. These extractions are suitable for a downstream next-generation sequencing approach.

Yeni Nesil Sıralama için Manyetik Boncuk Bazlı Sivrisinek DNA Ekstraksiyon Protokolü

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...