Lupus Eğilimli Farelerde Fekal Mikrobiyota Dinamiğinin Basit, Uygun Maliyetli Bir DNA İzolasyon Yöntemi Kullanılarak Analizi

Önerilen DNA izolasyon yöntemi, otoimmün hastalıklar fare modellerinde bağırsak mikrobiyota dinamiklerini incelemeye hizmet edebilir. Ticari olarak temin edilebilen kitlerle karşılaştırılabilir dışkı örneklerinden DNA elde etmek için daha çok yönlü, uygun maliyetli ve verimli bir yöntem önerilmektedir. Başlamak için, her fareyi ayrı ayrı kafesinden çıkarın, doğrudan anüsten bir dışkı topağı toplayın ve işlenene kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Numuneleri steril ve temiz forseps, tüp ve eldivenlerle işleyin. Önceden tartılmış, iki mililitrelik vidalı kapak tüpüne dondurulmuş bir pelet ekleyin ve dışkı ağırlığını gram cinsinden kaydedin, bu da dışkı peleti başına 0,02 ila 0,05 gram arasında olmalıdır. Pelet üzerine ince bir 0.1 milimetre cam boncuk tabakası, 500 mikrolitre lizis tamponu ve 200 mikrolitre% 20 sodyum dodesil sülfat ekleyin.

Boncuk, tüpü bir homojenizatörde dört dakika boyunca dövdü, ardından üç ila beş dakika girdap yaptı. Kabarcıkları ve köpüğü gidermek için tüpleri kısa bir süre santrifüj yapın. Mikrobiyota örneklerinden DNA çıkarmak için, 350 mikrolitre numune süpernatanı, herhangi bir enkaz olmadan, yeni, 1.5 mililitrelik bir çıtçıtlı kapak tüpüne aktarın.

500 mikrolitre fenol:kloroform:izoamil alkol, 25:24:1 oranında ve bir dakika boyunca vorteks ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, üst sulu fazın 180 mikrolitresini yeni, 1,5 mililitrelik bir çıtçıtlı kapak tüpüne aktarın. 180 mikrolitre kloroform ekleyin, ters çevirin ve karıştırın.

Bundan, sulu fazın 180 mikrolitresini yeni bir çıtçıtlı kapak tüpüne aktarın. Bir biyogüvenlik kabininde, 180 mikrolitre soğuk izopropanol ve 36 mikrolitre beş molar amonyum asetat ekleyin. Karıştırmak için birkaç kez ters çevirin ve tüpü 20 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.

Süper natantı atın, ardından peletleri 500 mikrolitre soğuk% 70 etanol ile birkaç kez yıkayın. Süper natantı atın ve pelet netleşene kadar tüpü kağıt mendil üzerinde 20 dakika boyunca baş aşağı kurutun. Peleti 50 mikrolitre moleküler sınıf suda askıya alın ve büyük DNA peletlerini tamamen çözmek için sıvıyı 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede ısıtın.

Isıtmadan sonra, kapaktaki yoğuşma damlacıklarını geri kazanmak için bu tüpleri bir dakika boyunca 3.400 kez G'de santrifüj yapın. Konsantrasyonu ölçün ve bir spektrofotometre kullanarak 260/280 oranını elde edin. Kaliteli DNA için bir oran genellikle 1.8 ila iki arasındadır.

Hazırlanan numuneleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca 600 kez G'de santrifüjleyin, 24 saat boyunca eksi 80 santigrat derecede dondurmadan önce. Daha sonra, mikrolitre başına bir ila 50 nanogram arasında değişen konsantrasyonlara sahip 20 mikrolitre numuneyi, sıralama için Argonne Ulusal Laboratuvarı'na gönderin. CX3CR1 reseptöründen yoksun fare suşu, vahşi tip MRL / lpr, MRL / lpr-CX3CR1 GFP / GFP farelere kıyasla farklı bir bağırsak mikrobiyota bileşimine sahiptir, filum Proteobakteriler gibi potansiyel olarak patojenik bakterilerle ilgili olarak belirli cinslerde önemli farklılıklar gösterir.

Numuneyi kirletmeye dikkat edin. Steril olması gerekiyor. Ayrıca, süpernatantı yeni bir tüpe aktarırken doğru pipetleme önemlidir.

Bu yöntem PCR, restriksiyon enzim sindirimi veya genomik kütüphane yapımı gibi moleküler analizler için uygundur. Lupusta, bağırsak mikrobiyotası ile lupus progresyonu arasında güçlü bir ilişki olduğunu kanıtladık.