Bu protokol, kit tipi, RNase R tedavisi, giriş miktarları ve bunların circRNA tespiti üzerindeki etkileri gibi circRNA kitaplık hazırlamanın temel yönlerini değerlendirmenin bir sonucudur. En iyi circRNA algılamasını sağlar ve kullanıcının ihtiyaçlarına bağlı olarak ayarlanabilir parametreler hakkında veri sağlar. Farklı örnek türlerinde circRNA'ların belirlenmesi, ifadelerinin dağılımını daha iyi anlamamıza yardımcı olacak ve bu moleküllerin işlevsel rolünün belirlenmesine zemin hazırlar.
Bu yöntem herhangi bir toplam RNA örneğine uygulanabilir. Protokolbaşlamadan önce RNA örneklerini buzda tutmak önemlidir. Hazırlıktan önce Agilent Bioanalyzer veya TapeStation'daki RIN ve DV200 değerlerini değerlendirin ve RNA ile çalışırken uygun prosedürleri uygulayın.
Toplam RNA'yı 39 mikrolitre RNase içermeyen suda dört mikrograma seyrelterek ve karıştırmak için yukarı ve aşağı borulandırarak başlayın. Ayrı bir tüpte, RNase R'yi mikrolitre başına iki birimlik bir çalışma konsantrasyonuna seyreltmek için 1x RNase R Tampon kullanın. Pipet 39 mikrolitre toplam RNA ve 10x RNase R Reaksiyon Tampon beş mikrolitre 1.5-mikrolitre reaksiyon tüpü içine, ve karıştırın.
Seyreltilmiş RNase R.Then tam reaksiyon hacmine pipet ayarlamak ve 10 kez yukarı ve aşağı boru lama tarafından çözelti karıştırın altı mikrolitre ekleyin. Tüpü 37 derecelik bir su banyosuna 10 dakika yerleştirin ve tam reaksiyon hacminin su banyosuna daldırDığından emin olun. Sonra, buz üzerinde tüp yerleştirin ve hemen RNA temizleme ve konsantrasyon ile devam edin.
Başlamadan önce, konsantreyi %100 etanolün 48 mililitresi ile karıştırarak RNA Yıkama Tamponu'nu hazırlayın ve arınma kolonlarını toplama tüplerine yerleştirin. Hazır olduğunuzda, RNaR işlem görmüş örneğe iki cilt RNA Bağlama Arabelleği ekleyin ve iyice karıştırın. Toplam 300 mikrolitre karışıma 150 mikrolitre %100 etanol ekleyin, tüm hacmi kolona aktarın ve 30 saniye santrifüj yapın.
Akışı kaldırın ve doğrudan sütuna 400 mikrolitre RNA Hazırlık Arabelleği ekleyin. 30 saniye santrifüj ve akışı atın. Ardından, sütuna 700 mikrolitre RNA Yıkama Tamponu ekleyin, 30 saniye santrifüj yapın ve akışı atın.
Yıkama Tamponbaşka 400 mikrolitre ekleyin, iki dakika için santrifüj, ve taze bir RNase-free 1.5 mililitre tüp sütun aktarın. Pipet ucunu kolon filtresinin hemen üzerinde tutarak doğrudan kolona 11 mikrolitre RNase içermeyen su ekleyin. Örnek oda sıcaklığında bir dakika oturup, ve sonra bir dakika için santrifüj edelim.
1,5 mililitrelik tüpte akış olduğundan emin olun ve sütunu atın. Saflaştırılmış RNA örneği eksi 80 derecede saklanabilir veya kütüphane hazırlığı için hemen kullanılabilir. Saflaştırılmış toplam RNA'nın 10 mikrolitresini 96 kuyulu bir PCR plakalı temiz bir kuyuya aktarın.
RRNA Bağlama Tampon beş mikrolitre ekleyin ve rRNA Kaldırma Mix beş mikrolitre ardından, sonra yavaşça pipet yukarı ve aşağı reaktifleri karıştırmak için. Plakayı kapatın ve önceden programlanmış ve önceden ısıtılmış bir termocycler bloğunda 68 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, plaka bir dakika oda sıcaklığında oturalım.
Mührü plakadan çıkarın ve numuneye 35 mikrolitre girdaplı oda sıcaklığında rRNA kaldırma boncukları ekleyin. Pipeti 45 mikrolitreye, pipetleri de iyice karıştırmak için 10 ila 20 kez yukarı ve aşağı ayarlayın. Plaka bir dakika oda sıcaklığında oturalım.
Plakayı manyetik bir standa aktarın ve bir dakika veya çözelti temize çıkana kadar orada kuluçkaya yatırın. Supernatant'ı plakadaki yeni kuyuya aktarın. Daha sonra plakayı manyetik standdan plaka standına aktarın.
Vortex RNA iyi dağılmış kadar boncuk temizleme ve örnek için boncuk 99 mikrolitre ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için, ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca tabak kuluçka. Plakayı manyetik standa aktarın ve beş dakika veya çözelti temize çıkana kadar orada bırakın, sonra tüm supernatant'ı kuyudan çıkarın ve atın.
Plaka hala manyetik stand üzerinde yken, boncukları bozmadan kuyuya 200 mikrolitre taze hazırlanmış %80 etanol ekleyin. 30 saniye boyunca kuyuda etanol bırakın, sonra çıkarın ve atın. Kuyuya 11 mikrolitre Elütion Tampon ekleyin ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipet.
Plakayı oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yatırın, sonra manyetik standa geri aktarın ve çözelti temize çıkana kadar orada tutun. Süpernatantın 8,5 mikrolitresini aynı plakaüzerindeki yeni bir kuyuya aktarın ve numune içeren her kuyuya 8,5 mikrolitre Elute, Primer, Fragment High Mix ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 10 kez iyice karıştırmak için, plaka mühür ve 94 santigrat derece önceden ısıtılmış bir termocycler sekiz dakika kuluçka.
Numuneyi dört dereceye kadar soğutun, plakayı termocycler'dan çıkarın ve kısa bir süre santrifüj edin. Bu protokol için TruSeq ve KAPA olmak üzere iki kütüphane hazırlama kitleri değerlendirildi. Genel olarak, TruSeq kiti ni kullanırken daha yüksek sayıda dairesel RNA ve daha düşük ribozomal RNA yüzdesi saptandı, bu yüzden daha fazla deney için TruSeq seçildi.
RNase R ön tedavisinin önemi, önceden tedavi edilmiş ve tedavi edilmeyen kütüphanelerden elde edilen veriler karşılaştırılarak değerlendirildi. Beklendiği gibi, önceden tedavi edilmeyen kütüphanelere kıyasla, daha yüksek sayıda dairesel RNA tutarlı bir şekilde önceden tedavi edilmemiş kütüphanelerde tanımlanmıştır. Giriş RNA miktarı dairesel RNA'ların daha yüksek bir çeşitliliğini tespit etmek için optimize edildi.
Kütüphaneler bir, iki ve dört mikrogram giriş RNA kullanılarak hazırlandı ve dört mikrogram toplam RNA kullanırken dairesel RNA türlerinin en yüksek çeşitliliği gözlendi. Optimize edilmiş protokol, dört sağlıklı donörden beş beyin bölgesinde ve altı sağlıklı donörün diğer doku tipleri için dairesel RNA bolluklarını karşılaştırmak için kullanılmıştır. Genel olarak, dairesel RNase daha yüksek bir bolluk diğer doku tiplerine göre beyinde gözlendi.
RNA ile çalışırken eldiven takmak, protokole başlamadan önce tezgah ve pipetleri RNase mendilleriyle veya spreyle iyice temizlemek ve RNA'yı önceden buzda tutmak da dahil olmak üzere uygun prosedürleri izlemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, tanımlanan circRNA kavşaklarının Sanger sıralanması gibi ortogonal doğrulama yapılabilir. Yeni circRNA'ların keşfi ve onların varlığına dair daha fazla kanıt, biyolojik işlevlerini keşfetmek için yeni bir araştırma alanı ortaya çıkarıyor.
