Bu protokol, kullanıcının alternatif birleştirmelerden geçebilen bir genomik ifade sistemi oluşturmasına olanak sağladığı ve bu durumda işlevleri ve hastalık ilişkisi için test edilebilen dairesel RNA'lar oluşturmasına olanak sağladığı için önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı, dairesel RNA oluşumu nda ve işlevinde alternatif birleştirme eğitimi alırken başkalarının moleküler biyoloji ve klonlamada bu protokolü kullanmalarının önünü açacak olmasıdır. Birisi ilk kez bu tekniği deneyen benim tavsiyepcr koşullarını optimize etmek olacaktır.
Degradeleri çalıştırın veya farklı tavlama sıcaklıkları ve uzatma süreleri ile touchdown PCR gerçekleştirin. Genellikle altı KB üzerinde uzun parçalar döngüsü başına bir KB uzatır ve farklı tavlama sıcaklıkları en iyi amplifikasyon için test edilmesi gerekir. Bu yöntemin gösterilmesi, kullanıcılara prosedürün özellikle astar ların neslinin daha zor yönlerini daha iyi görsel olarak göstereceği için önemlidir.
Bu prosedürü başlatmak için UCSC Genom Tarayıcısını yükleyin ve dairesel RNA oluşumu için gerekli tekrarlayan elementleri belirlemek ve bunları yapılara dahil etmek için kullanın. Daha da önemlisi, amplifikasyon için astartekrarlayan elemanların dışında olması gerekir. Dairesel RNA sırasını insan BLAT aramasına yapıştırın ve doğru organizmayı seçin.
Sırayı gönderin, tarayıcı görünümüne gidin ve 1,5 zamanlayıcıyı veya uygun şekilde uzaklaştırın. Ardından, kayan bir pencerede alt yazılarını tanımlamak için yinelenen öğelerin üzerinde fare. Alu elementler sinüs hattındadır.
Yanlış bir görüntü elde edilirse tarayıcıyı sıfırlamak için pencerenin altındaki varsayılan parça düğmesini kullanın. İlk görüntülemek için gidin, USCS Genom Tarayıcıüst satırında DNA penceresinde gösterilen DNA dizisini indirmek için. Sıralama biçimlendirme seçeneğinde genişletilmiş büyük/renk seçeneklerini seçin.
Varsayılan servis dosyasını daha düşük olarak seçin ve NCBI RefSeq için geçiş örneğini seçin. RepeatMasker için altı çizili, kalın ve Italik'i seçin. Gönder'i tıklatın.
Büyük harfler, intronlar ise küçük harfler olarak ekonlar olacaktır. Ekson/intron sınırlarını kontrol edin. Tarayıcı ters tamamlayıcıyı gösteriyorsa, geri dön ve doğru ekson/intron kenarlıkları gösterene kadar ters tamamlayıcı kutusunu seçin.
Ardından, dosyayı doğru yönlendirmeyle bir sözcük işleme belgesine kopyalayın ve ekseleri vurgulayın. Bu bölgelerdeki astarlar belirli dizileri yükseltmeyeceğinden, intron'un tekrarlayan bir bölgede başlayıp sona ermediğinden emin olmak için yükseltilecek parçaları seçin. Başlamak için, klonlama için astar tasarlamak için bir web aracı kullanın.
Vektör dizisi için, ekleme bölgesini son nükleotit olarak ekleyin ve daha sonra parçaları ekleyin. Vektör numaralandırması belirli bir ekleme sitesiyle başlamadığından, vektöre ekleme yeri bulunur ve akış aşağı kısmı yukarı akış sırasının önüne konur. Erime noktaları dört santigrat dereceden fazlaysa ve amplifikasyonda çalışmıyorsa astarları ayarlayın.
Bu çalışmada, dairesel RNA'lar üreten muhabir genler klonlanır ve analiz edilir. Optimize pcr ürünleri 1X jel yeşiliçeren% 1 agarose jel ayrılır. Tek tek bantlar enzimatik DNA montajında kullanılacak PCR ürünlerini temsil ediyor.
Bu bantlar daha sonra jel kesilir ve saflaştırılır. Saflaştırılmış PCR ürün jel yeşili ile beklenen boyuta doğru çalışmaz, böylece ürünler de ürünlerin doğru boyutta olduğundan emin olmak için daha sonra ethidium bromür ile boyanmış bir % 1 agarose jel ayrılır. Başlamak için, enzimatik DNA montaj kiti ayarlayın.
Vektör ve ekler bir ila iki molar oranında birleştirin. Daha sonra, 10 mikrolitre DNA montaj ana karışımı ekleyin. Örnekleri 50 derecede 60 dakika kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sırasında buz üzerindeki yetkili hücreleri eritin. Hücreler 50 mikrolitre lik bir hacimde olmalıdır. Ardından, toplam montaj reaksiyonu ile yetkili hücreleri dönüştürün.
Yetkili hücrelere soğutulmuş monte ürünün iki mikrolitre ekleyin. Tüpü 4-5 kez hafifçe hareket ettirerek karıştırın. Girdap etmeyin.
Karışımı 30 dakika buzüzerine yerleştirin. Isı 30 saniye boyunca 42 santigrat derecede karışımı şok. Sonra iki dakika buz üzerinde geri yerleştirin.
Bundan sonra, tüpe oda sıcaklığında 950 mikrolitre SOC ortam ekleyin. 300 RPM'de sallayarak 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yat. Bu kuluçka sırasında, uygun antibiyotik içeren sıcak iki seçim plakaları.
Kuluçkadan sonra, reaksiyon tüpünü 10,000 g'de 30 saniye boyunca santrifüj edin ve bir seçim plakasındaki hücrelerin %25'ini, diğerinde %75'ini dışarı atın. Bu plakaları bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Transfection başlamadan önce, kısıtlama sindirim dna kontrol edin.
Burada, 9'dan 12'ye kadar ekson içeren temsili bir tau minigeni, majör rekombinasyonları ekarte etmek için gösterilen restriksiyon enzimleri ile kesilir. Transfeksiyon için, ilk pH iki mililitre başına bir miligram konsantrasyonda suda lineer polietilen hidroklorür çözünür. PH'ı yediye çıkarmak için sodyum hidroksit kullanın ve 0,22 mikrometre filtre ile çözeltiyi steril filtreleyin.
Çözeltiyi kullanıma hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın. Daha sonra hücreleri altı kuyulu bir plakanın kuyularına bölün ve %10 FBS içeren DMEM ortamlarında bir gecede büyümelerine izin verin. Ertesi gün, steril bir tüp bildirilen genin bir mikrogram aliquot ve steril 150 milimoler sodyum klorür filtre steril 200 mikrolitre ekleyin.
Girdap ile karıştırın. Daha sonra, DNA her bir mikrogram için polietileninin üç mikrolitre bir oranda bu karışıma polietileninin çözeltisi ekleyin. Tüpün alt kısmında örnekleri toplamak için kısaca santrifüj.
Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra doğrudan HEK293 hücrelerine ekleyin. Hücreleri bir gecede %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, RT-PCR için RNA'yı yalıtmak için bir RNA izolasyon kiti kullanın. insan beyin dokularından elde edilen iki örnekten cDNA dairesel RNA astarlar circ tau exon 1210 ters ve circ tau exon 1211 ileri ile yükseltilir. Tau dairesel RNA'ya karşılık gelen beklenen bant görülürken, diğer güçlü bantlar insan genomuna uymayan eserlerdir.
Bu deney aynı PCR koşulları ile tekrarlanır, ancak ters transkripsiyon sadece circ tau exon 1210 ters astar ile gerçekleştirilmiştir. Yalnızca beklenen bant yükseltilir ve sıralama ile doğrulanır. RNA daha sonra doğrusal RNA'yı kaldıran RNa R ile tedavi edilir.
Dairesel RNA tedaviden sonra saptanabilirken, lineer RNA artık tespit edilebilir bir sinyal vermez. RNA transfeksiyon sonrası 24 saat izole edilir ve RT-PCR tarafından analiz edilir. Lineer tau mRNA amplifikasyonu ekson 10'un alternatif birleştirilmesi nedeniyle iki bant gösterir.
Onların oranı birleştirme faktörlerinin aşırı ifade değişir. Dairesel 1210 tau RNA amplifikasyon bazı birleştirme faktörleriözellikle Cdc2 gibi kinaz CLK2 ve SR protein 9G8 ifade tau circ RNA ifade bağımlılığı gösterir. Bu yordamı çalışırken hatırlanması gereken en önemli şey, bir minigen inşa ederken astarların tasarımı ve konumudur.
Astar tekrarlayan elemanlar içinde olmamalıdır ve yükseltilen parçaya bağlı olarak farklı koşullar altında optimize edilmesi gerekir. Bu yordamı takiben, uygulanabilecek diğer yöntemler dairesel RNA'ların işlevini test edilecektir. Kullanıcılar, kullanıcının ilgilendiği belirli dairesel RNA'nın işlevini belirlemek için proteinlerin çevirisini veya haczini test edebilirler.
Bu teknik, genomik parçaların minigen sisteminde kullanılmasının yolunu açarak, kullanıcının işlevlerini test edip tanımlamasına ve bazı yönlerden hastalıkla ilişkisini test etmesine ve tanımlamasına olanak tanıyan dairesel RNA'ları ifade edebilir. Bu tekniğin anlamı potansiyel tedaviler ve belirli bir hastalığın tanısı doğru uzanır, örneğin tauopapatiler, tau patolojisi ile ilişkili nörodejeneratif hastalıklar. MAPT olarak bilinen mikrotübül ilişkili protein tau'nun, hastalık patolojisine katkıda bulunduğuna inandığımız dairesel RNA'lar ürettiğini keşfettik ve bu yöntem bu dairesel RNA'ları tam olarak incelememize ve hastalıkla olan işlevlerini ve ilişkilerini belirlememize olanak sağlıyor.
Bu yöntem, dairesel RNA'ların daha iyi anlaşılması, işlevlerinin ne olduğu ve bazı hastalıklarda oynayabilecekleri rolün daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir. Bu yöntem, türler arasında dairesel RNA'ları ifade eden diğer minigenlerin klonlanmasında uygulanabilir ve bu yöntem işlevleri hakkında bilgi verebilir. PCR ürünlerinin amplifikasyonu, genomik DNA'dan güçlendirilmiş uzun parçalar ve parça içinde birden fazla tekrarlayan eleman olması yla en zor uymuş.
