Küçük RNA birçok biyolojik süreci düzenler. Bu nedenle bunları tespit etmek için hassas ve tarafsız yöntemler geliştirmek önemlidir. Protokol protokolümüz bu hedefe doğru adımlar atabiliyor.
Protokolümüz klasik küçük RNA kütüphane ödenek yöntemleridaha az önyargı sorunları muzdarip ve daha da önemlisi iki prong veya meso-RNA daha hassas algılamaları sağlar. Bitki mikro-RNA'ları gibi. Standart protokollere göre toplam RNA ayıkladıktan sonra.
Önceden 200 volt on beş dakika boyunca% 15 TBE üre jel çalıştırın. Ve toplam RNA beş ila yirmi mikrogram karıştırın, beş ila on beş mikrolitre hacmi, 200 mikrolitrelik bir tüp formamid yükleme boya eşit hacimli. 65 derece santigrat beş dakika sonra, ısıtmalı bir kapak ile bir termocycler, hemen buz tüpleri yerleştirin ve aralarında en az bir şerit ile jel ve örnek yük.
Bromofenol jel uzunluğunun yaklaşık üçte ikisi ne kadar göç etti kadar Sonra 200 volt jel çalıştırın. RNA'yı yüklemek için, ilk olarak bir nükleaz içermeyen 0,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünün altını 21 gauge iğneyle delinin ve delinmiş tüpü çekirdeksiz yuvarlak alt iki mililitrelik mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Daha sonra, bir transilluminator üzerinde jel görüntülemeden önce, on ila on beş dakika suda nükleik asit jel lekesi ile oda sıcaklığında jel kuluçka.
Örnek RNA'yı 17 ile 29 nükleotit merdiven bantları arasında kesin ve jel parçasını delinmiş tüpe aktarın. Jeli iki dakika boyunca maksimum hızda mikro santrifüjde aşağı doğru çevirin ve şimdi boş olması gereken 0,5 mililitrelik tüpü çıkarın. Ezilmiş jele 300 mikrolitre nükleaz içermeyen 0,3 azılak sodyum klorür ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında en az iki saat rotator üzerine yerleştirin.
Kuluçka sonunda, ezilmiş jel parçalarını bir spin sütununa aktarın ve mikro santrifüjde maksimum hızda iki dakika santrifüj edin. Unligated üç ana adaptör eliminasyonu için, iyice çıkarılan RNA örneği ile on mikrolitre nükleaz serbest su karıştırın ve karıştırma ile üç azı lı sodyum asetat altı mikrolitre ekleyin. Numuneye 40 mikrolitre manyetik saflaştırma boncukları ve 60 mikrolitre isopropanol ekleyin.
Ve oda sıcaklığında süspansiyonu beş dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka nın sonunda, çözelti netleşene kadar numuneyi manyetik bir rafa yerleştirin. Berrak supernatant çıkarın ve boncuklar için taze hazırlanmış% 80 etanol 180 mikrolitre ekleyin.
30 saniye sonra, etanol çıkarın ve kısaca tüp spin. Tüpün alt kısmında toplanmış olabilecek herhangi bir sıvıyı çıkarın ve 10 milimolar Tris'in 22 mikrolitresinde numuneyi yeniden askıya almadan önce boncukların iki dakika kurumasını bekleyin. İki dakika sonra çözelti net görünene kadar numuneyi manyetize edin.
Daha sonra, yeni bir tüpte üç molar sodyum asetat altı mikrolitre ile açık supernatant 20 mikrolitre karıştırın ve manyetik boncuk 40 mikrolitre ve% 100 izopropanol 60 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, süpernatant çıkarmadan önce, çözelti net görünene kadar örnek manyetize. Numuneyi, numunenin altında biriken etanolçıkarmadan ve tüpün altında biriken sıvıyı çıkarmadan önce 30 saniye boyunca 180 mikrolitre taze hazırlanmış %80 etanolle tedavi edin.
Boncukların iki dakika kurumasını sağladıktan sonra, çözelti netleşene kadar numuneyi manyetize etmeden önce 10 mikrolitre çekirdeksiz su yla iki dakika süreyle yeniden askıya alın. Daha sonra, yeni bir tüp için supernatant dokuz mikrolitre aktarın ve t4 RNA ligaz tampon bir mikrolitre ekleyin, ve örnek su bir micrcolitre. Jel arıtma için, yaklaşık bir saat boyunca bir yerli% 6 TBE jel pcr ürün beş, on ve yirmi mikrolitre çalıştırın.
Tamamlanmış jeli 10 ila 15 dakika suda nükleik asit jelle birlikte inkübe edin ve 150 baz çifti kütüphane bandının çıkarılmasını sağlamak için jeli bir transilluminator üzerinde görüntüleyin. Onları temsil eden 150 baz çifti bandı izole etmek zor olduğundan, bu bizim kütüphane, çok dikkatli bir şekilde jel kesmek gerekir yakından göç yan ürünlerin varlığı nedeniyle vardır. O zaman RNA'yı az önce gösterildiği gibi izole edin.
Ham sıralı dosya modifikasyonu için, sıralama çalışması sırasında oluşturulan fastq sıralı dosyaları indirin ve gerektiğinde bcl2fastq2 ile preform demultiplexing. Cutodapt kullanarak bağdaştırıcı dizilerini çıkarın ve gösterildiği gibi komutu kullanın. Sıralar okur terminal rasgele nükleotitleri kaldırmak için belirtildiği gibi seqtk kullanın.
Daha sonra 10 nükleotitten daha kısa dizileri atmak için awk komutunu belirtildiği gibi kullanın. Kesilmiş sıraları eşlemek için miRBase'i açın ve olgun fa dosyasını indirin. Veritabanındaki çeşitli organizmalardan kaynaklanan tüm mikro RNA'ların tam bir listesini vermek için U kalıntılarını T artıklarıyla değiştirmek için gösterildiği gibi komutu kullanın.
İlgi çekici organizmanın mikro RNA dizilerini, belirtildiği gibi komutla seçin ve okumaları bowtie2 kullanarak dosyaya eşleştirin, böylece hiçbir uyumsuzluk yok. Dizileri veritabanına okur hizalamak için aracı kullanın, bir okuma haritaları tamamen veritabanının mikro RNA için gerektiren, belirtildiği gibi herhangi bir uyuşmazlıkları dışarı. Ardından hizalamayan okumaları atmak için komutu kullanın.
PcR amplifiye kütüphane artan miktarda yüklendikten sonra bir jel üzerine gösterildiği gibi, beklenen boyuta karşılık gelen ürünler ayıklanabilir. Elüsyondan sonra, saflaştırılmış kütüphane bir kılcal jel elektroforez çip üzerinde kontrol edilebilir. Beklenen 150 baz çifti ürüne ek olarak ve adaptör dimerlerine karşılık gelen 130 baz çifti türünün artan oranı, genellikle artan miktarda PCR ürün yüklendiğinde gözlemlenmektedir.
Benzer sonuçlar, sentetik küçük RNA'ların karışımından gelen kütüphaneler kitlerden veya diğer malzemelerden reaktifler kullanılarak hazırlandığında elde edilir. Karşılaştırma için, aynı küçük RNA karışımı için daha önce yayınlanmış sonuçlar gösterilir. Burada, insan değiştirilmemiş ve iki başbakan O-methal modifiye bitki mikro RNA tespiti için standart TS protokolü ile protokol TS5 performansı için bir karşılaştırma gösterilir.
İnsan örneklerinde iki prime O-methal modifiye piRNA saptanması da test edildi. Gözlendiği gibi TS5 iki prime O-methal RNA tespiti için TS'den önemli ölçüde daha iyi biçimlendirilmiştir, ancak değiştirilmemiş RNA'lar için değil. Her örnek için farklı tarihlerde çoğaltma kitaplıkları hazırlayın.
Genellikle aynı anda yapılan çoğaltmalar arasında çok az varyasyon vardır, ya da farklı tarihlerde hazırlanan kütüphaneler arasında önemli bir varyasyon olabilir.
