Efflux pompaları Inhibisyonu Ile hematopoetik kök ve progenitor hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin akış Cytometrik değerlendirilmesi doğruluğu iyileştirilmesi

Mitokondriyal fonksiyon hematopoetik kök hücre kendini yenileme için önemlidir. Mitokondriyal aktivite iç mitokondriyal membran potansiyelinin bir reflektörüdür, tmrm ile ölçülebilir, bir hücre floresan, hücre perkastesi katyonik boya. Ksenobiyotik efflux pompalar HSC'de son derece aktiftir ve TMRM ekstrüzyonuna neden olur.

Bu protokolün en büyük avantajı, efflux pompaların inhibitörü Olan Verapamil'i kullanarak bu etkinin düzeltilmesidir. Fare uyluk kemik iliği izole ederek başlayın. İki posterior pençeleri kesmek için forceps ve keskin makas bir çift kullanın.

Sonra farenin ventral deri küçük bir snip yapmak ve germek. Femur ve tibia ayıklayın, femur başları yerinden değil özen yaparken, ve altı kuyu plaka kemikleri yerleştirin, boyama tampon 1.5 mililitre ile dolu. Kemiklerden kasları çıkarın ve kemik iliği çıkmak için izin, kemiklerin uçlarını kesti.

Temizlenmiş kemikleri 1,5 mililitre boyama tamponuyla yeni kuyulara yerleştirin. Sonra, kemik üç mililitreşlik şırınga ve 25 gauge iğne ile kemik iliği dışarı floş, kemik beyaz olana kadar. 1.5 mililitrelik bir tüptüm hücreleri toplamak ve 180 kez G beş dakika santrifüj, sonra supernatant atın.

Dikkatle buz soğuk ACK lysing tampon 300 mikrolitre pelet resuspend ve bir dakika için buz hücreleri koymak. Daha sonra bir mililitre boyama tamponu ekleyerek lysis'i hemen devre dışı bırakın. Hücreleri 180 kez g.Resuspend hücre pelet, beyaz görünmesi gereken beş dakika santrifüj, boyama tampon bir mililitre içinde.

Hücreleri 35 mikrometre naylon kafesle hücre süzgeci kapağı kullanarak filtreuygulayın ve mononükleer hücreler elde edin. Soyun kokteyli ve feorofore konjuge antikorlar hazırlayarak başlayın, el yazması talimatlara göre. Antikorları buzda tutun ve ışıktan koruyun.

Daha sonra, 180 kez G beş dakika için örnek santrifüj ve supernatant atın. Hücre peletine 400 mikrolitre silik kokteyl ve dört mikrolitre CD135 biyotinylated antikorlar ekleyin ve karışımı girdap. Sonra 30 dakika buzüzerinde kuluçkaya yatırın.

Kuluçkadan sonra, numuneyi üç mililitre boyama tamponu ekleyerek, 180 kez G'de beş dakika eğdirerek ve süpernatantı atarak yıkayın. Sonra antikor çözeltisi 400 mikrolitre ekleyin ve karışımı girdap. 30 dakika daha buzüzerinde kuluçkaya yatvere ve boyama tamponu ile yıkamayı tekrarlayın.

TMRM boyama çözeltisini hazırlamak için trombopoietin ve kök hücre faktörü ile 2,2 mikrolitre TMRM stok çözeltisi ve 1,1 mikrolitre Verapamil, 1,1 mililitre serumsuz hematopoetik kültür ortamı ekleyin. TMRM boyama çözeltisinin bir mililitresinde kemik iliğini yeniden askıya alın, girdap hızlıca ve 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Akış sitometresini tıkamamak için numuneyi 35 mikrometre naylon kafesle bir hücre süzgeci kapağı kullanarak filtreleyin.

Sonra DAPI bir mikrolitre ekleyin ve akış sitometri ile devam edin. Kemik iliği örneğini çalıştırın ve en az bir milyon etkinlik elde edin. Daha sonra cd135 Lin-negatif ve Lin-pozitif fraksiyonları tanımlamak için, pasifik mavisi için bir komplo canlı kemik iliği mononükleer hücreleri görüntüleyin.

Çok güçlü ataveya MPP fraksiyonu tanımlamak için APC/Cy7 karşı PE/Cy7 için Lin-negatif fraksiyonu çizin. Sonra hematopoetik kök hücre veya HSC fraksiyonu tanımlamak için, PerCP/Cy5.5 karşı APC için MPP fraksiyonu çizin. CD34 negatif HSC ve CD34 pozitif HSC fraksiyonlarına bölmek için FITC veya CD34 için HSC fraksiyonu görüntüleyin.

Son olarak her popülasyonda TMRM yoğunluğu elde edin. TMRM boyamadoğru çalıştı emin olmak için, örnek için FCCP bir mikrolitre ekleyin, bir milimolar son konsantrasyon için, ve beş dakika boyunca 37 derece santigrat de kuluçka. O zaman bir milyon etkinlik kazan.

FCCP ilavesi sonrasında TMRM yoğunluğu önemli ölçüde artırılmalıdır. Bu protokol, TMRM boyası ile çeşitli hücre popülasyonlarında mitokondriyal membran potansiyelini ölçmek için başarıyla kullanılmıştır. PBS ve FBS'nin kültür ortamıiçinde bulunmasının TMRM sinyal yoğunluğunu etkilediği gösterilmiştir.

Bu nedenle serumsuz genleşme ortamda TMRM boyama yapmak önemlidir. Hematopoetik kök hücreler, TMRM boyasını ekstrüzyon yapan ksenobiyotik efflux pompaların yüksek aktivite düzeylerini ifade eder. Yani TMRM profilleri de Verapamil veya Siklosporin H, pompaları blok varlığında değişir.

TMRM boyama doğruluğunu doğrulamak için, FCCP mitokondri depolarize ve TMRM yoğunluğunu azaltmak olabilir. Bu protokol, TMRE veya JC-1 dahil olmak üzere farklı bir mitokondriyal membran potansiyel boya ile HSC eğitimi için kolayca uyarlanabilir. Yanı sıra MitoTracker veya MitoSOX gibi diğer mitokondriyal boyalar.

Kemik iliği popülasyonu arasında efflux pompaların farklı aktivitesi nden kaynaklanan kritik konular açıktı. Yani bu protokol, önceki bulgular arasındaki tutarsızlığı azaltmayı amaçlamaktadır.