Bu teknik, drosophila melanogaster öğrenme ve bellek oluşumu nun altında yatan hücresel süreçler için fizyolojik bir parametre olarak sinaptik kalsiyum aktivitesinin gerçek zamanlı olarak gözlemini kolaylaştırır. İlişkisel eğitimöncesi ve sonrası kokulara verilen nöronal tepkileri karşılaştırarak, sinaptik aktivite ile tek tek meyve sineklerinde hafıza izlerinin oluşumu arasında doğrudan korelasyonlar çizebiliriz. Hangi ilgi belirli nöronlar ifade transgenik meyve sinekleri üretmek için bir genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi çapraz kadın-bakire ve erkek istenilen GAL4 ve UAS yapıları taşıyan sinekler, ve yaş kadın soyundan kadar üç ila altı gün sonra eclosion.
Görüntüleme için bir sinek hazırlamak için, özel hazırlanmış bir görüntüleme odasına bir buz anestezi sinek yerleştirmek için ince forseps kullanın. Toraks ve bacakları odanın altındaki elektrik telleriyle temas halinde ve başı düz bir şekilde konumlandırmak için bir kesme mikroskobu kullanmak. Net yapışkan bant ile yerinde sinek düzeltmek ve anten kapalı ve toraks sadece ön kısmı maruz bırakarak, baş ın etrafında bant bir pencere kesmek için bir cerrahi neşter bıçak kullanın.
Dikkatle mavi ışık kür tutkal ile başın yanve arka çevreleyen içbükey-convex çeneler tarafından tutulan bir böcek pin kullanın. Ve tutkal ayarlamak için mavi ışık yayan LED lamba kullanın. Tutkal tamamen ayarlandığında, sinek kafasının sırt yüzeyinden sertleşmemiş tutkal artıklarını temizleyin ve başın açıkta kalan manikülünü bir damla Ringer çözeltisi ile kapatın.
Çok ince bıçaklı bıçak bıçağı kullanarak, başın arka boyunca mitikül ile kesilmiş, ocelli başlayan ve kolayca forseps kullanılarak yırtılmış olabilir mite bir flep oluşturmak için gözlere her iki medial kesme. İlgi beyin bölgesini bloke edebilir herhangi bir aşırı mitikül çıkarın ve dikkatle herhangi bir trakea sırt yüzeyini temizlemek için ince çalgılar kullanmak, beyin dokusunun kendisi bozulmasını önlemek için özen. Doku enkaz alanını temizlemek için ringer çözeltisini gerektiği gibi çıkarın ve yenileyin.
Ve bir hipodermik koku dağıtım iğnesi sinek başının yaklaşık bir santimetre yerleştirin, dikkat alarak anten için koku iletimi engelleyebilecek hiçbir şey yoktur. Daha sonra görüntüleme odasını hipodermik koku dağıtım iğnesi ile koku dağıtım sistemine bağlayın. Ve sineğin anestezi ve ameliyattan kurtulması için 10 dakika bekleyin.
GFP tabanlı kalsiyum göstergelerinin görselleştirilmesi için, kızılötesi lazer ile donatılmış çok foton mikroskobun lazerini ve titreşim izole bir tabloya 920 nanometre uyarma dalga boyuna yerleştirilen bir su daldırma amacını ayarlayın ve gfp bandpass filtresi kurun. Z ayar buzlesini kullanarak beynin Z ekseninden geçerek ilgi çekici beyin bölgesini bulun. Tarama süresini en aza indirmek için taramayı yalnızca ilgi alanına odaklamak için kırpma işlevini kullanın.
Ve kafanın ön aşağı bakacak şekilde tcan görünümünü döndürün. Ardından kare boyutunu 512'ye 512 piksel olarak ayarlayın ve taranacak bölgeyi seçin. En az dört hertz bir kare oranı elde etmek için, her kare için hesaplanan taramayı süresi dikkate alınarak.
Koku uyandıran kalsiyum geçici görselleştirme için, görüntü edinme yazılımı ve koku dağıtım programı bağlama yeteneğine sahip önceden programlanmış bir makro paket başlatın ve bir F0 temel değeri oluşturmak için 6,25 saniye mikroskop yazılımı ölçüm başlar. Koku dağıtım sisteminde, belirli koku kabı vanalarının açılıp kapanması yla tetiklenen LED'lerin aydınlatılarak burada belirtilen 2,5 saniyelik koku uyarıcısını teslim edin. Ardından koku ofset sonunda kayıt 12,5 saniye.
Daha sonra aynı şekilde ikinci ve üçüncü bir odorant için teslimat tekrarlayın. Bu kurulumda bağkurlu klimayı gerçekleştirmek için, 12 90 volt elektrik şoku ile birlikte 60 saniye boyunca şartlı uyarıcı artı-koku sunmak için bilgisayar kontrollü koku dağıtım sistemini kullanın. 60 saniyelik bir aradan sonra, elektrik çarpması olmadan 60 saniye boyunca tek başına şartlı uyarıcı-eksi-koku mevcut.
Eğitim sonrası kokuyu, eğitim aşamasını tamamladıktan üç dakika sonra eğitim öncesi koku stimülasyon protokolünü tekrarlayarak tekrar kalsiyum transansyonu uygulayın. Ardından görüntüleme dosyalarını daha sonraki görüntü çözümlemesi için uygun bir biçimde kaydedin. Burada temsili mantar vücut çıkışı nöron görüntüleri, gösterildiği gibi elde edilen görülebilir.
Nöronun aksonal bölmelerinde ifade edilmeyen dHomer-GCaMP3 sensörünün özel bölümsel ekspresyonu dendritik bölmede noktalama işareti gösterir. Daha düşük genlik koku yanıtları dHomer-GCaMp3 ifade sineklerde görülebilir rağmen açık, sitosolik GCaMP6f ifade sinekler ile karşılaştırıldığında. Burada, tek bir sineğin temsili kalsiyum izleri, bireysel preparatlar arasında elde edilebilen gürültü seviyesi ve genlikte farklılıklar göstermektedir.
Bu teknik, alt hücresel düzeyde görselleştirme imkanını, koku gösterimlerinin nasıl modüle edildir ve bellek aşamalarının klima ile nasıl oluştuğunu açmıştır. Bu tür deneyler mantar gövdesi gibi karmaşık beyin yapıları anlayışımızı genişletmek için hayati önem taşımaktadır, ve nasıl bağşılı anılar nöronların dağıtılmış popülasyonları arasında depolanır karakterize etmek.
