Bu yöntem, Şekil 1 &#39;de şematik olarak kullanımı için yerleştirme bloğu tasarımları ve Daniela Pelz çizilmesi için Pablo Traversa geliştirilmesinde Silke Sachse ve Beate Eisermann kabul eder. Biz Silke Sachse&#39;dir Pavan Ramdya ve yazının yorumları için Raphael Rytz minnettarız. R. Bell Boehringer Ingelheim Vakfı Doktora Bursu tarafından desteklenmektedir. R. Benton laboratuvarında Araştırma Bağımsız Araştırmacı Desteği ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı başlayarak bir Avrupa Araştırma Konseyi tarafından finanse edilmektedir.

1. Montaj Blok Meclisi <ol><li> Pleksiglas montaj bloğu (Şekil 1A) (edinilebilir planı verilen kesin özelliklere göre yapılmalıdır <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> ) Sineğin Kolay montaj ve diseksiyon izin vermek. Arkasından vidalar vasıtasıyla iplik ancak bloğun ön ötesine uzanmaz; konumlarını (2,7 bakınız) hayvanın hazırlanması sırasında ayarlanacaktır. </li><li> Hassas bir matkap kullanarak, bu noktada blok kalınlığının azaltılması, sinek vücudunun yer açmak için yüzeyin altında kazma, sinek için dairesel odasının üst sınır burnunu sürtmek. </li><li> Bir neşter dik bir bakır ızgara kesin ve bir &quot;yaka&quot; oluşturmak için yarık altına kapatın. Bu sineğin ekleme yardımcı olacak şekilde iki sonuç kapakları, seviye olduğundan emin olun. </li><li> Bir kürdan ile sinek için dairesel odasının üstünde montaj blok üzerine superglue küçük bir damla koyun. Yarık blok (Şekil 1A) üzerine odaklanmaktadır, böylece tutkal ve konumu üzerine bakır ızgara yerleştirin. Hafifçe bastırarak Taşan tutkalı kaldırın. Cımbız ile, her iki tarafta flep altında tutkal küçük damla ve yarık düz aşağıya baktığından böylece bloğun ön üzerinde ızgara katlayın. Izgara üst bloğu ile seviye olduğundan emin olun. Tamamen kurumasını bekleyin. </li><li> Bir tel tutucu monte: yarısında plastik bir coverslip kesilmiş ve bir &quot;U&quot; şeklinde yapmak için merkezi bir parça kaldırın. &quot;U&quot; üstünde tutkal tel parçası için balmumu kullanın; kablosu çok gergin yapmazlar. </li><li> Antennal kalkanı kurmak: Bir kağıt delik açma ile bir plastik coverslip bir delik olun. 0.5 x 0.7 cm lameller kenarları kesin. Tutkal sonra delip plastik yapışkan bant coverslip ve delikten maruz banda etanol bir damla koyunyapıştırıcı çıkarın. </li></ol> 2. Hayvan Hazırlık <ol><li> Uygun genotip Sinekler - yani &quot;sürücü&quot; ve aktivite-muhabiri transgenlerin istenilen kombinasyonu taşıyan - 1-3 haftalık olmalıdır; genç sineklerin tırnak etlerinin çok yumuşak ve zordur. Deneyler ve transgen ekspresyonu düzeylerinin maç için farklı genotipleri doğrudan karşılaştırmalı gerektirdiğinde, sinekler yaşa bağlı fizyolojik farklılıkları önlemek için yaştaki olmalıdır. Cinsiyet önemli değil, biz daha büyük başları vardır ve işlemek için daha kolay olduğundan erkek sineklerin kullanmayı tercih eder. </li><li> Buz üzerinde soğutularak sinekler uyutmak. </li><li> Montaj blok içine bir sinek tanıtın. Kanat eklemi tarafından sinek tutun ve kaydırın, bakır ızgara yarık boyunca birinci dorsal yüzey, onun boynu (Şekil 1B-C) tarafından askıya böylece. Gerekirse onu aşağı bakıyor kadar döndürün. </li><li> F önünde güzel bir kaktüs omurga yerleştirin(Şekil 1B-C) kaçmasını önlemek için ly kafasını. Hareket etmesini önlemek için hortum önüne kaktüsü omurga yerleştirin. Balmumu kullanarak blok kaktüs omurga Fix. Başın üst bloğunun üst seviyede olduğundan emin olun. </li><li> Rosin küçük bir damla (etanol içinde çözülmüş) ile blok sineği kafası sabitlemek. Nemlendirilmiş bir kutuya blok yerleştirin ve yaklaşık bir saat sertleşmeye rosin sağlar. </li><li> Anten ve kafa arasındaki cuticular kat olarak; forseps kullanarak tutucu (1.5 bakınız balmumu tarafı dışarı) tel ileri antennal plaka çekin ve bırakın. Balmumu ile bloğun ön tutucu sabitleyin. </li><li> Blok yerleşik vidaları kullanarak, yavaşça antennal plakası ve kafa arasında biraz boşluk yaratmak için ileri tel tutucu itin. </li><li> Merkezi olarak konumlandırılmış deliği ile sinek başının üstünden antennal kalkan (1.6 bakınız) yerleştirin. Montaj bloğun üst balmumu ile tespit edin. </li><li> Bir bıçak-splitter, cu kullanmakalkanı bant ta küçük bir delik anten arkasındaki sineğin başının kütikül açığa. Deliği sızmasını önlemek için hazırlanması gözler ötesine olmamalıdır. </li><li> Iki bileşenli silikon bant ve üst deri arasındaki deliği kapatın. Sineğin başın üst emdiği silikon çıkarın. </li><li> Bir damla yerleştirin Drosophila Ringer kafasına (130 mM NaCl, 5 mM KCI, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 36 mM sakaroz, 5 mM HEPES, pH 7.3), tuzlu su. Antenler tamamen kuru kalmalıdır: sızıntı olmadığından emin olun. Bir safir bıçak kullanarak, manikür bir delik kesti. İlk olarak, hafifçe doğrudan anten arkasında cuticular kat boyunca skor, sonra arka gözler boyunca ve ocelli olandı. Son olarak, gol kenar üzerinde kütikula parçasını katlayıp antennal sinirleri Severing önlemek için alt kesti. </li><li> Dikkatlice ince cımbızla bezleri ve trakea çıkarın. Drosophila ile tekrar tekrar durulayın </em&gt; Ringer, kafasına büyük bir damla bırakarak. </li></ol> 3. Koku Stimulus Teslimat <ol><li> Koku şırınga: kovan içine derin pedi itmek için pipet ucu kullanarak, uygun bir çözücü içinde istenildiği gibi seyreltilmiş üstüne temiz forseps ve pipetle (filtresi kullanılarak uçları) koku 20 ul, 2 ml olan bir plastik şırıngaya bir selüloz pedi eklemek . Tak ve kap şırınga istenene kadar. En az 3 ayda bir (veya daha sık yüksek uçucu ve / veya sık kullanılan kokuları için) Taze koku dilüsyonları hazırlanmalı ve yeni pedleri sadece her kayıt oturumu öncesinde koku şırıngalar için hazırlanmalıdır. Koku konsantrasyonu çürümeye olması nedeniyle, üçten fazla uyarımlar için koku pedleri kullanmayın. </li><li> Ismarlama olfactometer (Şekil 2): ​​bir birincil hava akımı (1 L / dak) Teflon boru (0,4 mm, iç çap) ile yönlendirilir; yukan Bu tüp çıkış, bir ikincil hava akımı (1 L / dak 27 cm ) ilave edilir. Her iki hava akımları membran pompaları tarafından oluşturulan ve edilmektedirakış hızı, iki bağımsız akış ölçerler tarafından kontrol edilmektedir. Bakım (yani ~% 60 daha fazla) aşırı nemlendirme önlemek için alınması gereken ancak hava akımları, gaz yıkama şişe su geçerek nemlendirilmelidir olabilir. Ikincil hava akışı bir koku şırınga veya boş bir şırınga yoluyla yöneliktir: şırınga piston delip bir şırınga iğne (1,2 mm dış çapı) vasıtasıyla hava akımına bağlanır. Bir valf kontrol ünitesi (örneğin Harvard Apparatus VC6) üzerinden kumanda üç-yollu manyetik vana temiz hava ve koku uyaran arasında geçiş yapmak için kullanılır. </li></ol> 4. In vivo Imaging&#39;de <ol><li> Biz 20x su nesnel (örneğin Zeiss W &quot;Planla-Apochromat&quot; 20x / 1,0 M27 DIC) (Şekil 2) ile donatılmış dik bir floresan mikroskop (örneğin dik duran Sahne Zeiss Axio Examiner D1) kullanılarak burada görüntüleme açıklar. G-Camp (eksitasyon / emisyonu: 488/509 nm) görüntüleme için: 450-490 nm eksitasyon filtresi, aşağıdaki özelliklere sahip bir filtre blok kullanmak, Dikroik ayna (T495LP) ve 500-550 nm emisyon filtresi (Chroma ET). Mikroskop altında sineği içeren yerleştirme bloğu yerleştirin. Sineğin antenlerin önünde olfactometer yaklaşık 0.5 cm çıkış yerleştirin. </li><li> Bu sinek kafasına Ringer çözeltisi dokunana kadar objektif indirin. Baş kapsülü deliğe merkezli ve sınırlarını odak vardır; böylece parlak alan aydınlatma altında, pozisyon hazırlama izleyici ile bakıyorum. Eğer etiketli nöronlar (G-Camp bazal yeşil floresan belirginlik) görünceye kadar floresan ışığı geçin ve odağı ayarlayın. </li><li> Bir Charge-coupled cihazı ile görüntü alarak ilgi glomerül ince odak (CCD) kamera (örneğin CoolSNAP-HQ2 Dijital Kamera Sistemi) uygun toplama yazılımı (örneğin Metafluor) (Şekil 3A) kullanılarak mikroskop üzerine monte edilmiş. Görüntülü alana ikaz ışığı sınırlamak için aydınlatma ışık yolu diyafram kapatın. </li><li> Koku uyarılmış kaydedilmesini içinaktivite, 4 Hz satın hızını ayarlamak ve CCD kamera dinamik aralığında floresans değerlerini elde etmek için pozlama süresini ayarlamak, ancak en az 12-bit dinamik çözünürlüklü, 1000 (keyfi adet), daha düşük değil. Pozlama süresi G-Camp photobleaching azaltmak için, mümkünse, 100 ms geçmemelidir. Kamera uzaysal çözünürlüğü izin veriyorsa, pozlama süresini azaltmak için (bir dijital piksel içine sağlıklı bir yer olacak çip kuyuların sayısı) binning artırabilir. Biz hazırlık 210x135 mikron karşılık 350x225 piksel (2x2 bir binning ile), görüntülerini elde. Bu ayarlar beyazlatma muhabiri sınırlandırarak iyi uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip G-CAMP&#39;ın glomerüler koku kaynaklı yanıtları yakalamak için optimal. </li><li> Ölçüm parametreleri ayarlayın. Biz genellikle koku stimulasyonu genellikle satın alma döneminin başlangıcından sonra 4 saniye başlayan (çerçeve 15) ve kalıcı bir saniye (u, 10 saniye (yani 40 kare) için kayıtntil çerçeve 19). Bir sinek hazırlanması normalde sık photobleaching nedeniyle muhabiri floresan sinyali geri dönüşü olmayan bir düşüş sınırlı 25-30 farklı koku uyarılara ile test edilebilir. Inter-uyaran aralığı gözlenen tepki gücü ve photobleaching oranı bağlıdır. Duyusal uyum önlemek için inter-uyarıcı aralığının uygun uzunlukta deneme deneylerde pozitif kontrol koku (biliniyorsa) tekrarlanan sunumu ile yaklaşık belirlenebilir. Bu koku İçerme verilen bir dizi her ~ 10 uyaranlar sürekli canlılık ve hazırlık tutarlı bir yanıt doğrulama izin verebilirsiniz. </li></ol> 5.. Veri İşleme ve Analizi Veri ImageJ (Mac biophotonics plug-in ile kullanılarak işlenir <a href="http://www.macbiophotonics.ca/">www.macbiophotonics.ca</a> ) ve aşağıdaki gibi Matlab ve Ar özel yazılmış programlar: <ol><li> Örnek hareket eserler için düzeltin:StackReg / TurboReg en &quot;katı cisim&quot; modunda (kullanarak bir hayvan hazırlama (örneğin 40 karelik her 30 ölçüm) karşılık gelen tüm görüntüleri hizalamak <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg">bigwww.epfl.ch / Thevenaz / stackreg</a> ImageJ olarak). Bu adımda ölçümleri arasındaki içinde ve toplama çerçeve ile ilgili olarak etiketlenmiş nöronların pozisyonda kaymalar kaldırmak için gereklidir. Ancak, xy düzleminde vardiya kaldırmak mümkündür. Odak güçlü değişiklik olduğunda Veri atılmalıdır. </li><li> Bireysel (40 kare) 10-ikinci ölçümler içine segment yığını. </li><li> Eserler beyazlatma için Doğru: floresan ışığına maruz kalma, tek bir ölçüm sırasında 10 çürümeye floresan neden olur. Bazı durumlarda, bu veriler analiz önce bu bozunma düzeltmek için önemlidir. Her ölçüm için bir arka plan çerçevesi hesaplayabilirsiniz. Bu uyaranın başlangıcından (örneğin kare 6-14) önce birkaç kare ortalama olmalıdır. Bu backg tarafından her kare bölüngöreceli floresans değişiklikleri elde etmek çerçeve yuvarlak. G-CAMP etiketli alanı içindeki tüm piksellerin ortalama her kare için ortalama göreceli floresan değerini hesaplayın. Koku yanıt (20 kare bizim durumumuzda uyaranın başlangıcından sonra) zaman uyarıcı ve sıfır ağırlık önce kareye kadar güçlü ağırlık vererek, ortalama floresan eğriye çift üstel sığdır. Her pikselin göreceli floresans eğrisinden takılan eğri çıkarın. Ham verilerin yeniden elde etmek için arka plan çerçevesi tarafından düzeltilmiş çerçeveleri çarpın. Sinyali ölçüm ucunu (inhibitör ya da çok güçlü bir uyarıcı yanıtları uyarılmış durumunda örn) (Şekil 4) ile taban geri değilse düzeltme Bu tür bir yanıt dinamiği bir modifikasyonu yol açabilir. Ağartma eser düzeltme birçok durumda yararlı olmakla beraber, bir ağartıcı düzeltme uygulanması halinde, geçici parametreleri yorumlanması dikkatle yapılmalıdır. </li><li> Floresans göreceli değişiklik (&amp; De HesaplaLTA; F / F) (her ölçüm, her kare için F i-F 0) / F F 0 i th çerçevesi için i floresans değeri siluetlerindeki (5.3), ve F 0 * 100, ölçümü. </li><li> Aktivite izleri (Şekil 5A) elde etmek için 10 piksel bir çapa sahip bir glomerulus (Şekil 3B) ilgi dairesel bir bölge içinde ortalama mesafe kadar taşınmış / F hesaplamak. Eğer istenirse, ImageJ (Şekil 5A) kullanılarak heatmaps içine bu izleri dönüşümü. </li><li> Yanıt zirve sırasında ortalama mesafe kadar taşınmış / dört kare F stimülasyon öncesi ortalama mesafe kadar taşınmış / dört kare F çıkarılarak yanıt tepe genliği hesaplayın. Aynı prosedür mekansal tepkisi kalıpları (bakınız Şekil 3B) ve göstermek için (Şekil 5B bakınız) sinekler boyunca ilgi belirli bölgelerde tepkisi amplitüd ölçmek için hem kullanılır. Pik yanıt da uyaranın saat veya averagin sırasında eğrisinin altındaki alanda entegre ile belirlenebiliryanıtı, maksimum yaklaşık g çerçeveleri. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Biz OSNs 29,30 birkaç farklı popülasyonlar (aktif koku co-reseptör IR8a için organizatörü kontrolü altında G-28 CaMP1.6 ifade sineklerin propiyonik asit-uyarılmış yanıtları kaydetmek ve analiz etmek için yukarıdaki protokoller Şekil 3-5). % 1 propiyonik asit ile stimülasyonu G-Camp floresans artışlar ortaya çıkarır - hücre içi kalsiyum artışı gösteren - iki glomerüller, DC4 ve DP1l (Şekil 3B) innerve OSNs içinde. Line etkinliği izleri, heatmaps ve tepe yanıtları bir çubuk: Biz Şekil 5&#39;te birden çok sinek veri temsil eden farklı yollar göstermek. Propiyonik asit-uyarılmış yanıtlar DC4 ve DP1l belirgin tepe genlikleri ve zamansal dinamiği var. Yanıtlar genellikle sağlam olmasına rağmen Ayrıca, bireysel hayvanlar arasındaki değişkenlik (o görmek glomerüller hem de görülebiliyorŞekil 5A in atmaps). Tepe yanıtları (Şekil 5B) Kantitasyonu hayvanlar üzerindeki farklı glomerüller ve farklı kokular arasında basit bir istatistik karşılaştırma sağlar. Ancak, koku ile uyarılan kalsiyum yanıtları düzgün olmayan zamansal dinamiği olabilir, ve tek bir değer ile büyüklüğü miktarının bu karmaşıklığı göz ardı edecektir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig1.jpg" /> Şekil 1. Montaj bloğu şematik sinek tanıtılması ve yakın çekim (C) bir üst bakış (31 uyarlanmıştır) (A) önce ve sonra (B). <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig2.jpg" /> Şekil 2. Deneysel set-up şematik. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig3.jpg" /> Şekil 3. Adım 2.8 (sol panel) ve ante ham floresan görüntü sonra sinek hazırlık (A) Üstten görünümnnal loblar G-CaMP1.6 (;: G-CaMP1.6: IR8a organizatörü UAS gal4 Genotip) ile etiketlenmiş. DC4 ve DP1l glomerül sırasıyla bunların morfoloji, boyutu ve konumu ile ayırt edilebilir ve kırmızı ve mavi ile işaretlenmiştir. Propionik asit (% 1 v / v) ile cevap (B) Renk kodlu görüntüsü. Görüntünün (aynı zamanda Şekil 5A bakınız) adım 5,6 açıklandığı gibi hesaplanır tepkisinin tepe mesafe kadar taşınmış / F karşılık gelir. Soldaki colorscale% mesafe kadar taşınmış / F değeri belirtir. Siyah daireler (bkz. Şekil 5) yanıtları ölçmek için kullanılan faiz bölgenin konumunu ve boyutunu gösterir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig4.jpg" /> Şekil 4. Floresan muhabiri sinyal beyazlatma gideriliyor. Adım 5.3 &#39;te tarif edildiği gibi ağartıcı düzeltme etkisi örnekleri. Sol panelde örnek veri tepkisinin şeklinde önemli bir değişiklik olmadan düzeltilebilir. Sağ panelde Örnek verileri ciddi etkiler edilirolasılıkla ağartıcı düzeltme tarafından ed sinyal düşüyor ve koku uyaran sona ermesinden sonra bazal korunduğundan. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig5.jpg" /> Şekil 5 (a) En:. Glomeruli DC4 (sol) ve DP1l (sağ) propionik asit (% 1 v / v) ile kalsiyum tepkilerin zamansal dinamiği. Siyah izleri sekiz hayvanlar arasında ilgi bölgesi (Şekil 3B bakınız) içinde ortalama mesafe kadar taşınmış / F medyan göstermektedir. Gri yüzey dağılımının birinci ve üçüncü kartiller arasındaki aralık gösterir. Ortanca ve çeyrek değerler Sunum ortalama ve standart hata daha değişkenliği ve gözlenen yanıtların dağılımı hakkında daha fazla bilgi sağlar. Yeşil ve kırmızı kutuları kare Şekil 3B gösterilir ve Şekil 5B sayısal tepe yanıtları hesaplamak için ortalama göstermektedir. Alt: heatmaps mesafe kadar taşınmış / F değerleri repr ile, ayrı satırlara tek tek tüm hayvanlar için yanıt verileri göstermekcolorscale (en sağda) tarafından esented. Yatay siyah çubuklar uyaranın zaman ve süresini belirtiniz. (B) DC4 ve DP1l glomerül için sekiz hayvanlar üzerinde propiyonik asit medyan tepe yanıtları. Hata çubukları dağılımının birinci ve üçüncü kartiller arasındaki aralık göstermektedir.

<ol>
	<li>Galizia, C. G., Rossler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+olfactory+systems+in+insects:+anatomy+and+function.">Parallel olfactory systems in insects: anatomy and function.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 399-420 (2010).</li><li>Vosshall, L. B., Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Architecture+of+Smell+and+Taste+in+Drosophila.">Molecular Architecture of Smell and Taste in Drosophila.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 505-533 (2007).</li><li>Wilson, R. I., Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+events+in+olfactory+processing.">Early events in olfactory processing.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 163-201 (2006).</li><li>Masse, N. Y., Turner, G. C., Jefferis, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+information+processing+in+Drosophila.">Olfactory information processing in Drosophila.</a> Curr. Biol. 19, 700-713 (2009).</li><li>Hansson, B. S., Anton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+morphology+of+the+antennal+lobe:+new+developments.">Function and morphology of the antennal lobe: new developments.</a> Annu. Rev. Entomol. 45, 203-231 (2000).</li><li>Galizia, C. G., Joerges, J., Kuttner, A., Faber, T., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-in-vivo+preparation+for+optical+recording+of+the+insect+brain.">A semi-in-vivo preparation for optical recording of the insect brain.</a> J. Neurosci. Methods. 76, 61-69 (1997).</li><li>Galizia, C. G., Menzel, R., Holldobler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+odor-evoked+glomerular+activity+patterns+in+the+antennal+lobes+of+the+ant+Camponotus+rufipes.">Optical imaging of odor-evoked glomerular activity patterns in the antennal lobes of the ant Camponotus rufipes.</a> Naturwissenschaften. 86, 533-537 (1999).</li><li>Okada, K., Kanzaki, R., Kawachi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+voltage-sensitive+dye+imaging+of+an+in+vivo+insect+brain.">High-speed voltage-sensitive dye imaging of an in vivo insect brain.</a> Neurosci. Lett. 209, 197-200 (1996).</li><li>Carlsson, M. A., Knusel, P., Verschure, P. F., Hansson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+Ca2++dynamics+of+moth+olfactory+projection+neurones.">Spatio-temporal Ca2+ dynamics of moth olfactory projection neurones.</a> The European journal of neuroscience. 22, 647-657 (2005).</li><li>Galizia, C. G., Vetter, R. S., Christensen, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Insect Sensory Neuroscience (Frontiers in Neuroscience). 13, 349-392 (2005).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca&#40;2+&#41;+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca&#40;2+&#41; probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li><li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+quantitative+Ca2++measurements+using+improved+cameleons.">Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 2135-2140 (1999).</li><li>Martin, J. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brulet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+Ca+signalling+in+the+brain+of+Drosophila.">In vivo bioluminescence imaging of Ca signalling in the brain of Drosophila.</a> PLoS One. 2, 275-275 (2007).</li><li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Ca2++stores+contribute+to+odor-induced+responses+in+Drosophila+olfactory+receptor+neurons.">Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons.</a> The Journal of Experimental Biology. 213, 4163-4173 (2010).</li><li>Yuste, R., Miller, R. B., Holthoff, K., Zhang, S., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapto-pHluorins:+chimeras+between+pH-sensitive+mutants+of+green+fluorescent+protein+and+synaptic+vesicle+membrane+proteins+as+reporters+of+neurotransmitter+release.">Synapto-pHluorins: chimeras between pH-sensitive mutants of green fluorescent protein and synaptic vesicle membrane proteins as reporters of neurotransmitter release.</a> Methods Enzymol. 327, 522-546 (2000).</li><li>Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+and+specificity+in+Drosophila+pheromone+perception.">Sensitivity and specificity in Drosophila pheromone perception.</a> Trends Neurosci. 30, 512-519 (2007).</li><li>Elliott, D. A., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GAL4+system+:+a+versatile+system+for+the+expression+of+genes.">The GAL4 system : a versatile system for the expression of genes.</a> Methods Mol. Biol. 420, 79-95 (2008).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).</li><li>Yagi, R., Mayer, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+LexA+transactivators+and+their+use+in+combination+with+the+Drosophila+Gal4+system.">Refined LexA transactivators and their use in combination with the Drosophila Gal4 system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16166-16171 (2010).</li><li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+System:+A+Repressible+Binary+System+for+Transgene+Expression,+Lineage+Tracing,+and+Mosaic+Analysis.">The Q System: A Repressible Binary System for Transgene Expression, Lineage Tracing, and Mosaic Analysis.</a> Cell. 141, 536-548 (2010).</li><li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li><li>Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+expressed+cameleon+in+Drosophila+melanogaster+is+used+to+visualize+olfactory+information+in+projection+neurons.">Genetically expressed cameleon in Drosophila melanogaster is used to visualize olfactory information in projection neurons.</a> Curr. Biol. 12, 1877-1884 (2002).</li><li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly.">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36, 463-474 (2002).</li><li>Sachse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+plasticity+in+an+olfactory+circuit.">Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit.</a> Neuron. 56, 838-850 (2007).</li><li>Pelz, D., Roeske, T., Syed, Z., de Bruyne, M., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+receptive+range+of+an+olfactory+receptor+in+vivo+&#40;Drosophila+melanogaster+Or22a&#41;.">The molecular receptive range of an olfactory receptor in vivo &#40;Drosophila melanogaster Or22a&#41;.</a> J. Neurobiol. 66, 1544-1563 (2006).</li><li>Silbering, A. F., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+odor+mixtures+in+the+Drosophila+antennal+lobe+reveals+both+global+inhibition+and+glomerulus-specific+interactions.">Processing of odor mixtures in the Drosophila antennal lobe reveals both global inhibition and glomerulus-specific interactions.</a> J. Neurosci. 27, 11966-11977 (2007).</li><li>Reiff, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies.">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li><li>Abuin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+olfactory+ionotropic+glutamate+receptors.">Functional architecture of olfactory ionotropic glutamate receptors.</a> Neuron. 69, 44-60 (2011).</li><li>Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+ionotropic+glutamate+receptors+as+chemosensory+receptors+in+Drosophila.">Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila.</a> Cell. 136, 149-162 (2009).</li><li>Pelz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Functional characterization of Drosophila melanogaster Olfactory Receptor Neurons. , (2005).</li><li>Ai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+sensing+by+the+Drosophila+olfactory+system.">Acid sensing by the Drosophila olfactory system.</a> Nature. 468, 691-695 (2010).</li><li>Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Brain+Imaging:+Fluorescence+or+Bioluminescence,+Which+to+Choose?.">In Vivo Brain Imaging: Fluorescence or Bioluminescence, Which to Choose?.</a> Journal of Neurogenetics. , 1-23 (2008).</li><li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies.">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front. Neural Circuits. 1, 3-3 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9715-9720 (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada açıklanan hazırlama ve analiz yöntemleri buna karşılık gelen bir sürücü transgen kullanılabilir olduğu antennal lob (OSNs, LN ve PNS) nöronların herhangi bir popülasyonda koku-uyarılmış yanıtları analiz etmek için kullanılabilir. Bir floresans mikroskobu kullanılarak uygulaması tarif iken, bu hazırlama optik görüntüleme eşit konfokal ya da iki-fotonlu mikroskopi 22,32 kullanılarak gerçekleştirilebilir. Nitekim, bu son araçların nöronların ekspres özellikle çok sayıda gazeteci, görüntülerin çözünürlüğünü azaltabilir geniş alan mikroskobu saçılım problemi hafifletmek. Bu hazırlık, genellikle en az yarım saat koku-uyarılmış cevapların kayıtları izin verir, ama bu kez kaydedilen ölçüm sayısı ve uzunluğuna bağlı olarak önemli ölçüde daha uzun veya daha kısa olabilir, maruz kalma süresi her kare ve inter-stimulus aralığı için kullanılır. Ayrıca, iki-foton uyarması floresan rep photobleaching azaltabilirÖrter yanı sıra, hücresel fototoksisite, uzun zaman periyotları boyunca 22,32 ölçümü izin vermek üzere. Ne olursa olsun mikroskop tercih, baş kapsülü içindeki uçucu beyin hareketi birçok problemi de olduğu zaman olduğu gibi hayvanlarda görüntüleme. Düzeltme hareketi küçük sorunları (adım 5.1) düzeltmek mümkün olmakla birlikte, genellikle daha iyi sadece son derece kararlı hazırlıkları kaydetmektir. Hareket artefaktları azaltmak için stratejiler şunlardır: (i) düzgün kaktüs dikeni sineğin probosis kısıtlayıcı, (ii) eicosane (önceki 2.6 adıma) (eicosane de eritilebilir ile sahnede onları sabitleme ile sineğin bacakları immobilizing ~ 37 ° C, bu amaçla havya) ucu genişletmek ve geliştirmek için bir gümüş tel kullanmak, (iii) ince cımbız ile özefagus (antennal sinirler arasındaki görünür) nicklemek. Burada kullanılan G-CaMP1.6 ek olarak, G-cAMP ve diğer kalsiyum göstergelerinin optimize versiyonlarını, mevcutonların sinyal-gürültü oranı, bazal floresans ve temporal dinamikleri 12,28,33 hangi farklıdır. Sensörün hassas bir seçim dikkate tüm bu özellikleri, nöron tipi analiz edilecek ve biyolojik söz adreslenen almalıdır. Şu sensörler sağlam sinek nöral aktivitenin optik görüntüleme potansiyelini geliştirmeye devam edecektir belirli genetik sürücü hatları 35 sayısındaki artış ile birleştiğinde aksiyon potansiyelleri 12,34, ve daha da geliştirilmesi ile oldukça iyi bir korelasyon kalsiyum değişiklikleri rapor.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Satıcı </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Cactus omurga </td><td> Bahçe merkezi </td><td></td><td> Çok esnek değildir, ~ 7mm uzun ince </td></tr><tr><td> Reçine </td><td> Yaylı enstrüman dükkanı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> İki bileşenli silikon </td><td> TEFE </td><td> KWIK-SIL </td><td></td></tr><tr><td> Özel pleksiglas montaj blok yaptı </td><td> Temin edilebilir Blueprints <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bakır ızgaraları </td><td> Athene Izgaralar </td><td> G220-5 </td><td> Normal olarak, elektron mikroskopi numuneler için kullanılır. </td></tr><tr><td> Vidalar </td><td> Donanım mağaza </td&gt; <td></td><td> 2 mm çapında </td></tr><tr><td> Plastik lamelleri </td><td> Plano-em </td><td> L4193 </td><td> 22 X 22 mm </td></tr><tr><td> Havya ipuçları </td><td> Conrad Elektronik </td><td> 830283-62 </td><td></td></tr><tr><td> Ayarlı güç kaynağı </td><td> Conrad Elektronik </td><td> 511407-62 </td><td></td></tr><tr><td> İnce tel </td><td> Isabellenhütte </td><td> Isa-ohm </td><td> 0.013 mm </td></tr><tr><td> Eicosane </td><td> Sigma </td><td> 21,927-4 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axioexaminer D1 </td><td></td></tr><tr><td> CCD kamera </td><td> Visitron </td><td> CoolSnap HQ </td><td></td></tr><tr><td> Metafluor </td><td> Visitron </td><td></td><td> Acquisition yazılımı </td></tr><tr><td> Monokromatör </td><td> Visitron </td><td> Visichrome </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Kırılabilir bıçakları </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 10050-00 </td><td></td></tr><tr><td> Bıçak Holder </td><td> TEFE </td><td> 14134 </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire bıçak </td><td> TEFE </td><td> 500314 </td><td> Çift bıçak 1mm kenarlı </td></tr><tr><td> Membran gaz pompaları </td><td> KNF Neuberger AG </td><td> NMP 830 hastada KVE </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire bıçak tutucu </td><td> TEFE </td><td> 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Üç yollu vana </td><td> Lee Şirketi </td><td> LFAA1200118H </td><td> Yapılandırma E </td></tr><tr><td> Rotametre 500 ml / dakika </td><td> Analyt-MTC </td><td> 112-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Rotametre 5 L / dak </td><td> Analyt-MTC </td><td> 102-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Balmumu </td><td> Siladent Technik </td><td> 209212 </td><td>; </td></tr><tr><td> Selüloz pad </td><td> Kettenbach Tıp </td><td> 31003 </td><td></td></tr><tr><td> Cımbız </td><td> Plano-em </td><td> T5130 </td><td> Dumont biyoloji # 5 </td></tr><tr><td> Şırınga </td><td> BD </td><td> 300928 </td><td> 2ml, Discardit II, 2adet </td></tr><tr><td> Iğneler </td><td> Braun Sterican </td><td> 4665120 </td><td> 1.2mm OD </td></tr></tbody></table>

calcium imaging of odor-evoked responses in the drosophila antennal lobe

Antennal lob böcek beyindeki birincil koku alma merkezi ve omurgalı koku ampul 1-5 anatomik ve fonksiyonel eşdeğerini temsil eder. Dış dünyada koku bilgileri de ifade belirli bir koku reseptör bağlı olarak adlandırılan neuropil glomeruli ile farklı bölgelere ayırmak koku sensor nöronları (OSNs) tarafından antennal lob iletilir. Burada olan süreçler hem yerel internöronlardan ile OSN aksonları sinaps (LN), yüksek koku beyin bölgelerine koku bilgi aktarmak çok farklı glomerüller, ve projeksiyon nöronlar (PNS), innerve olabilir. Antennal lobda OSNs, LN ve PNS faaliyet Optik görüntüleme - geleneksel sentetik kalsiyum göstergeleri (örneğin kalsiyum yeşil, Fura-2) veya voltaj duyarlı boyalar (örneğin RH414) kullanarak - uzun anlamak için önemli bir teknik olmuştur nasıl koku uyaranlara zamansal ve mekansal desen olarak temsil edilirböcekler 6-10 birçok türde glomerüler faaliyet. Gibi floresan kalsiyum göstergeleri G-Camp 11,12 ve Cameleon 13, biyolüminesens kalsiyum göstergesi GFP-aequorin 14,15 veya sinaptik iletim muhabir olarak genetik olarak kodlanmış nöral aktivitenin gazetecilere, geliştirilmesi, synapto-pHluorin 16 yaptı meyve sineği olfaktör sistemi, nörofizyolojik görüntüleme özellikle erişilebilir Drosophila melanogaster, onun kapsamlı tarif, moleküler elektrofizyolojik ve nöroanatomik özellikleri 2,4,17 tamamlayıcı. Bu gazetecilere seçici koku uyarılmış nasıl yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip incelemek koku devresi içindeki nöronların tanımlanan toplumlarda ikili transkripsiyonel kontrol sistemleri (örneğin GAL4/UAS 18, lexA / LexAop 19,20, Q sistemi 21) ile ifade edilebilir nöral aktivitenin, temsil modüle ve 22-24 dönüşür &lt;/&gt; Sup. Burada G-KAMPI 25-27 kullanarak Drosophila antennal lobda koku uyarılmış yanıtları ölçmek için hazırlık ve analiz yöntemleri açıklanmaktadır. Hayvan hazırlık minimal invaziv ve geniş alan, floresan konfokal ve iki foton mikroskoplar kullanılarak görüntüleme adapte edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe at JoVE.com

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Biz yaşam antennal lobda koku uyarılmış kalsiyum yanıtları ölçmek ve analiz etmek için kurulmuş bir tekniği tarif<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Koku-uyarılmış Cevaplarının Kalsiyum Görüntüleme Drosophila Antennal Lob

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

calcium-imaging-odor-evoked-responses-drosophila-antennal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

25.8K Görüntüleme.  University of Lausanne. Biz yaşam antennal lobda koku uyarılmış kalsiyum yanıtları ölçmek ve analiz etmek için kurulmuş bir tekniği tarif Drosophila melanogaster.

Video: Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

Optik Yansıtma ve Otofloresans Sinyalleri kullanarak, Fare Koku Ampul Görüntüleme Koku-Uyarılmış Etkinlikler

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Nörobilim

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

All organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is especially important in insects, which use their olfactory systems to respond to, and discriminate amongst, complex odor stimuli. These odors elicit behaviors that mediate processes such as reproduction and habitat selection1-3. Additionally, chemical sensing by insects mediates behaviors that are highly significant for agriculture and human health, including pollination4-6, herbivory of food crops7, and transmission of disease8,9. Identification of olfactory signals and their role in insect behavior is thus important for understanding both ecological processes and human food resources and well-being.
	To date, the identification of volatiles that drive insect behavior has been difficult and often tedious. Current techniques include gas chromatography-coupled electroantennogram recording (GC-EAG), and gas chromatography-coupled single sensillum recordings (GC-SSR)10-12. These techniques proved to be vital in the identification of bioactive compounds. We have developed a method that uses gas chromatography coupled to multi-channel electrophysiological recordings (termed 'GCMR') from neurons in the antennal lobe (AL; the insect's primary olfactory center)13,14. This state-of-the-art technique allows us to probe how odor information is represented in the insect brain. Moreover, because neural responses to odors at this level of olfactory processing are highly sensitive owing to the degree of convergence of the antenna's receptor neurons into AL neurons, AL recordings will allow the detection of active constituents of natural odors efficiently and with high sensitivity. Here we describe GCMR and give an example of its use.
	Several general steps are involved in the detection of bioactive volatiles and insect response. Volatiles first need to be collected from sources of interest (in this example we use flowers from the genus Mimulus (Phyrmaceae)) and characterized as needed using standard GC-MS techniques14-16. Insects are prepared for study using minimal dissection, after which a recording electrode is inserted into the antennal lobe and multi-channel neural recording begins. Post-processing of the neural data then reveals which particular odorants cause significant neural responses by the insect nervous system.
	Although the example we present here is specific to pollination studies, GCMR can be expanded to a wide range of study organisms and volatile sources. For instance, this method can be used in the identification of odorants attracting or repelling vector insects and crop pests. Moreover, GCMR can also be used to identify attractants for beneficial insects, such as pollinators. The technique may be expanded to non-insect subjects as well.

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

Olfactory cues mediate many different behaviors in insects, and are often complex mixtures comprised of tens to hundreds of volatile compounds. Using gas chromatography with multi-channel recording in the insect antennal lobe, we describe a method for the identification of bioactive compounds.

Böcek antennal Lob Gaz Kromatografisi-Multi-ünite Recordings (GCMR) kullanarak Olfaktör Uçuculuk tanımlanması

All  organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their  behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

Drosophila melanogaster Öğrenme Kaynaklı Sinaptik Plastisite Vivo Optik Kalsiyum Görüntüleme

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte function is not fully known. Pericytes have been suggested to be involved in capillary development, regulation of endothelial barrier tightness and trancytosis activity, regulation of capillary tone and to play crucial roles in certain brain pathologies.
Pericytes are challenging to investigate in the intact brain due to the difficulties in visualizing processes in the brain parenchyma, as well as the close proximity to the other cells of the NVU. The present protocol describes a method for isolation and culture of primary bovine brain capillary pericytes and their following usage in calcium imaging studies, where effects of agonists involved in brain signaling and pathologies can be investigated. Cortical capillary fragments are allowed to attach to the bottom of culture flasks and, after 6 days, endothelial cells and pericytes have grown out from the capillary fragments. The endothelial cells are removed by gentle trypsinization and pericytes are cultured for 5 additional days before passaging.
Isolated pericytes are seeded in 96-well culture plates and loaded with the calcium indicator dye (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) to allow for measurements of intracellular calcium levels in a plate reader setup. Alternatively, pericytes are seeded on coverslips and mounted in cell chambers. Following loading with the calcium indicator (Cal-520 AM), calcium live-imaging can be performed using confocal microscopy at an excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 510-520 nm.
The method described here has been used to obtain the first intracellular calcium measurements from primary brain capillary pericytes, demonstrating that pericytes are stimulated via ATP and are able to contract in vitro.

Brain capillary pericytes are essential players in the regulation of blood-brain barrier properties and blood flow. This protocol describes how brain capillary pericytes can be isolated, cultured, characterized with respect to cell type and applied for investigations of intracellular calcium signaling with fluorescent probes.

Sitosolik Kalsiyum Ölçümleri ve Kalsiyum Görüntüleme Çalışmaları için Beyin Kılcal Perisit Kültürü

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using calcium as a proxy for neuronal activity, these techniques provide a way to monitor the responses of individual cells within large neuronal ensembles to a variety of stimuli in real time. We, and others, have applied these techniques to image the responses of individual geniculate ganglion neurons to taste stimuli applied to the tongues of live anesthetized mice. The geniculate ganglion is comprised of the cell bodies of gustatory neurons innervating the anterior tongue and palate as well as some somatosensory neurons innervating the pinna of the ear. Imaging the taste-evoked responses of individual geniculate ganglion neurons with GCaMP has provided important information about the tuning profiles of these neurons in wild-type mice as well as a way to detect peripheral taste miswiring phenotypes in genetically manipulated mice. Here we demonstrate the surgical procedure to expose the geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, initial steps for data analysis, and troubleshooting. This technique can be used with transgenically encoded GCaMP, or with AAV-mediated GCaMP expression, and can be modified to image particular genetic subsets of interest (i.e., Cre-mediated GCaMP expression). Overall, in vivo calcium imaging of geniculate ganglion neurons is a powerful technique for monitoring the activity of peripheral gustatory neurons and provides complementary information to more traditional whole-nerve chorda tympani recordings or taste behavior assays.

Here we present how to expose the geniculate ganglion of a live, anesthetized laboratory mouse and how to use calcium imaging to measure the responses of ensembles of these neurons to taste stimuli, allowing for multiple trials with different stimulants. This allows for in depth comparisons of which neurons respond to which tastants.

Tadı Uyaranlara Fare Genikül Ganglion Nöron Yanıtlarının In vivo Kalsiyum Görüntülemesi

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Retina Ganglion Hücre Tabakasında Kalsiyum Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the impaired light-sensing photoreceptor cells in the degenerated retina, aiming to partially restore vision by inducing visual percepts. One common avenue of investigation involves the design and production of implantable devices with a flexible physical structure, housing a high number of electrodes. This enables the efficient and precise generation of visual percepts. However, with each technological advancement, there arises a need for a reliable and manageable ex vivo method to verify the functionality of the device before progressing to in vivo experiments, where factors beyond the device's performance come into play. This article presents a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer (GCL) following electrical stimulation. Specifically, the following steps are outlined: (1) fluorescently labeling the rat retina using genetically encoded calcium indicators, (2) capturing the fluorescence signal using an inverted fluorescence microscope while applying distinct patterns of electrical stimulation, and (3) extracting and analyzing the calcium traces from individual cells within the GCL. By following this procedure, researchers can efficiently test new stimulation protocols prior to conducting in vivo experiments.

Yazar Spotlight: Kalsiyum Görüntüleme Kullanarak Nöral Elektrik Stimülasyonuna Yenilikçi Bir Yaklaşım 

Retinal prostheses have the ability to generate visual perceptions. To advance the development of new prostheses, ex vivo methods are needed to test devices before implantation. This article provides a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer when subjected to electrical stimulation.

Elektrikle Uyarılan Düz Monte Retinalarda Kalsiyum Görüntüleme

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...