Protokolümüz, aynı veya zıt yönlendirilmiş sitosiskelet elmotor proteinlerinden oluşan ekipler tarafından kargonun taşınmasını yöneten biyofiziksel mekanizmaları araştırmak için tasarlanmıştır. Moleküler yapı için DNA origami kullanarak, bu yöntem, tam olarak tanımlanmış kargo şekilleri üzerinde motorların türü, sayısı ve konumu için seçebilirsiniz. Bu protokol mikrotübül bazlı motorlar dynein ve kinesin üzerinde duruluyor iken, aktin tabanlı motor miyozin yanı sıra işbirliği içinde çalışan diğer protein sistemlerine uyarlanabilir.
Bu protokolün zorlu bir yönü, ısı ve mekanik kuvvete duyarlı oldukları için motor proteinlerinin saflaştırma süreci boyunca bütünlüğünü ve etkinliğini korumaktır. Galaktoz organizatörü aracılığıyla motor protein büyümesi ve ekspresyonu teşvik etmek için, 30 santigrat derecede üç ila dört günlük kuluçka için bir maya-pepton-dekstroz kültür plakası üzerinde ilgi dondurulmuş maya zorlanma çizgi steril bir aşılama değnek kullanın. Kültürün dördüncü gününde, 600 nanometredeki optik yoğunluk 1,5 ile 2 arasında olduğunda, maya hücrelerini santrifüj le toplayın ve suda bulunan peletleri yıkayın ve hücreleri tek bir şişede birleştirin.
Toplama için hücreleri tekrar döndürün ve peleti yaklaşık iki mililitre çift distile su yla yeniden askıya alın. Sonra yavaş yavaş dondurulmuş maya hücre pelet üretmek için bir seferde bir damla sıvı azot içine hücre bulamaç dağıtmak için 10 mililitrelik pipet kullanın. Motor protein arınması için, dondurulmuş maya peletlerini ince bir toz haline getirmek için sıvı nitrojenle önceden soğutulmuş bir bıçak tipi kahve öğütücüsi kullanın ve maya tozunu önceden soğutulmuş, 100 mililitrelik cam kabına buz üzerinde aktarın.
Tampon son konsantrasyonu 1X aşmaması için toz takviyeleri ile taze hazırlanmış 4X lysis tampon küçük bir hacim ekleyin ve hızlı bir şekilde toz eritmek için bir spatula ile sürekli karıştırma ile 37 derecelik santigrat su banyosunda beaker yerleştirin. Lysate 1X son tampon konsantrasyonu getirmek için takviyeleri ile ek 4X tampon ekleyin. Son hacmi genellikle 25 ve 30 mililitre arasındadır.
Sonra santrifüj ile maya hücreleri toplamak ve buz üzerinde yeni bir 50 mililitrekonik tüp içine supernatant içeren çözünür protein aktarın. IgG yakınlık arınma için, protein ekstresi için yıkanmış afinite boncuk süspansiyon 200 mikrolitre ekleyin ve nazik rotasyon ile bir saat boyunca dört derece santigrat karışımı kuluçka. Kuluçka sonunda, karışımı, boncukları dört santigrat derecede hazırlamak için kullanılan kromatografi sütununa süzün, ardından buzüzerinde yıkama başına beş mililitre yıkama tamponu ile iki yıkama yapın.
İkinci yıkamadan sonra, tamponun sütundan tamamen boşalmasını sağlayan beş mililitre TEV tamponuyla boncukları buz üzerinde durulayın. DNA oligonükleotid etiketleme için, kromatografi sütun kapağı, ve TEV tampon 100 mikrolitre ile takviye motor boncuk lar kuluçka 10 ila 15 dakika oda sıcaklığında saflaştırılmış benzilguanin oligo ile takviye, yavaşça dakikada bir kez boncuk yeniden sususpend. Kuluçka sonunda, taze TEV tampon en fazla 200 mikrolitre motor boncuk resuspension izin vermek için tüpün alt recapping önce, sadece gösterildiği gibi yıkama başına taze TEV tampon ile boncukdört kez yıkayın.
TEV dekoltesi için, motor boncuk süspansiyonunu iki mililitrelik, yuvarlak alt, mikrosantrifüj tüpe aktarın ve motor boncukları mikrolitre başına yaklaşık 0,3 ünite TEV protaz ile 16 santigrat derecede nazik bir dönüşle inkümal edin. Kuluçka sonunda, motor boncuk santrifüj ve tüpün altındaki karışımı toplamak. Daha sonra, karışımı bir spin sütununa aktarmak için kesilmiş bir P1000 pipet ucu kullanın ve karışımı az önce gösterildiği gibi santrifüj edin.
TEV-cleaved, saflaştırılmış motorları içeren filtratı toplayın ve mikrotübül afinitesini arındırmak için 50 mikrolitrelik hacimlerde filtratı aliquot layın. Sonra flaş eksi 80 derece santigrat depolama için sıvı nitrojen aliquots dondurmak. Şasi arıtma için, arınma önce günün geç öğleden sonra, hafifçe katman 80 mikrolitre bir santrifüj tüp içinde origami katlanır tampon gliserol konsantrasyonu her.
Katmanlar arasındaki sınırlar biraz görünür olmalıdır. Dört derece santigrat bir gecede kuluçka sonra, katman 10% gliserol origami katlanır tampon gradyan üst tabakası üzerinde katlanmış şasi çözeltisi, ve şasi ile gradyan santrifüj. Santrifüj sonunda, bir yukarıdan aşağıya doğru degrade 50 mikrolitre fraksiyonları toplamak ve% 2 agarose jel bireysel kuyular içine her kesir beş mikrolitre yükleyin.
70 voltta 90 ila 120 dakika sonra, kullanılan DNA jeli lekesi için uygun koşulları kullanarak jelgörüntü. Seçilen ilgi fraksiyonlarının sayısal laştırılmış konsantrasyonları uygun standart spektroskopik yöntemler kullanılarak belirlenebilir. SDS-PAGE analizi, son filtrat yaklaşık 350 kilodalton net, keskin bir bant gösterir gibi, maya dan dynein başarılı ayıklama onaylamak için kullanılabilir.
TEV protease de son filtrat mevcut ve yaklaşık 50 kilodaltons net bir bant oluşturur. Mikrotübül afinite arınması sonra, dynein açık, tek bant olarak görünür 350 kilodaltons, kinesin hafif bulaşma olarak görülebilir ise, yaklaşık 120 kilodaltonbirden fazla bant. TEV proteazek ek olarak, tubulin belirgin bir miktar da son supernatant görülebilir.
DNA origami yapılarının katlanması agarose jel elektroforez ilerler, saf unfolded iskele iplikçik ve origami katlama gösteren katlama reaksiyonu arasında hareketlilik bir kayma ile. Ayrıca, katlanır reaksiyon şasi yapılarının bazı multimerization varlığını gösterir. Motor şasi topluluklarının hareketliliği TIRF filmlerinden üretilen kymograflarda kolayca tespit edilebilir ve ölçülebilir, çünkü yedi dinamin proteinine konjuge esnek şasinin kymografları nispeten tutarlı hızlarda son derece alel selakar lık lar gösterir.
Prosedürün her adımında motor proteinlerinin sıcaklığını dikkatle kontrol etmek hayati önem taşır. Motor proteinlerve DNA origami şasi saflaştırma sonrasında, iki bileşen bir TIRF mikroskop altında toplulukların hareketlilik tahlilleri için konjuge edilebilir. Bu yöntem, motor toplulukların acil hareketliliğini yöneten biyofiziksel ve biyokimyasal mekanizmaların deşifre edilmesini sağlar.
