Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8, çift yönlü bir motor proteindir. Cin8, mikrotübüllerin eksi uç yönünde tek bir molekül olarak hareket eder ve bir dizi farklı deneysel koşul altında yönlülüğü değiştirir. Araştırmamızın genel amacı, Cin8'in çift yönlü hareketliliğini düzenleyen faktörleri ve yapısal elemanları inceleyerek çift yönlü hareketlilik mekanizmasını anlamaktır.
Bu protokol, maya hücrelerinde aşırı eksprese edilen GFP tipi tam uzunlukta Cin8'in saflaştırılmasını, tek moleküllü motilitesi testini ve ardından tek moleküllerin ve Cin8 kümelerinin hareketli özelliklerinin analizini kapsamlı bir şekilde açıklamaktadır. Bu ayırma önemlidir, çünkü Cin8'in yönlülüğü, mikrotübül üzerindeki kümelerde birikmesinden etkilenir. Bu teknik, mayadan diğer nükleer proteinleri saflaştırmak için kolayca uyarlanabilir.
Ek olarak, floresan yoğunluğuna göre boyut gruplarına ayrılması gereken herhangi bir floresan partikülüne uygulanabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvar müdürümüz Dr. Alina Goldstein-Levitin ve doktora sonrası bursiyerler Dr. Nurit Siegler olacak Dr. Mary Popov; Tatiana Zvagelsky, Maya Sadan ve Shira Hershfinkel, yüksek lisans öğrencileri; ve Neta Yanir, Yahel Abraham, Roy Avraham ve Meital Haberman, laboratuvarımızdan lisans öğrencileri. Başlamak için, Cin8-GFP-6His aşırı ekspresyonu için plazmid içeren Saccharomyces cerevisiae hücrelerini, 28 santigrat derecede %2 rafinoz ile desteklenmiş, bir litre maya seçici ortamdaki üstel büyüme fazına kadar büyütün.
Daha sonra% 2 galaktoz ekleyerek Cin8-GFP-6His aşırı ekspresyonunu indükleyin ve 600 nanometrede absorbansı ölçerek maya kültürünün büyümesini izleyin. Galaktoz ilavesinden beş saat sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Hücreleri lizis tamponunda tekrar askıya alın ve sıvı azotta dondurun.
Daha sonra, soğutulmuş bir harç ve havane kullanarak, dondurulmuş hücreleri sıvı azotta öğütün. Öğütme sırasında sıvı azot eklemeye devam edin, böylece ekstraktlar donmuş kalır. Hücre lizisini bir faz veya diferansiyel girişim kontrast mikroskobu altında izleyin.
Sonra toprak hücrelerini çözün ve santrifüj edin. Süpernatantı iki mililitre Nikel-NTA ile doldurulmuş bir yerçekimi akış kolonuna yükleyin ve lizis tamponu ile önceden dengeleyin. Süpernatantın sütundan dışarı akmasına izin verin.
Kolonu beş sütun hacimli lizis tamponu ile yıkayın, ardından 25 milimolar imidazol ile desteklenmiş beş sütun hacimli lizis tamponu ile yıkayın. Daha sonra Cin8-GFP-6His elüsyon tamponu ile etkisiz hale getirin. Salınan örnekleri SDS-PAGE fraksiyonasyonu ile analiz edin, ardından Coomassie mavi boyama ve anti-GFP antikoru ile incelenen Western leke analizi ile analiz edin.
Cin8-GFP-6His içeren fraksiyonları bir araya getirdikten sonra, dakikada 0.5 mililitre akış hızında ve 1.5 megapaskal bir kolon basınç sınırında boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırın. Aynı anda 280 nanometrede absorbansı izleyin. Cin8-GFP tetramerine karşılık gelen fraksiyonları toplayın ve bunları SDS-PAGE ve Western blotting ile analiz edin.
Daha sonra seçilen fraksiyonları aliquot, çıtçıtlayın ve eksi 80 santigrat derecede kullanana kadar saklayın. Biyotin ve rodamin etiketli mikrotübülleri polimerize etmek ve stabilize etmek için, reaksiyon bileşenlerini 1.5 mililitrelik bir tüpte karıştırın ve karışımı 37 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra 80 mikrolitre ılık genel tübülin tamponu ekleyin, dikkatlice karıştırın ve santrifüj yapın.
Süper nantantı atın ve 50 mikrolitre sıcak genel tübülin tamponu ile yukarı ve aşağı pipetleyerek, peleti dikkatlice yeniden askıya alın. Ardından süspansiyonu 28 veya 37 santigrat derecede saklayın. 647 nanometre rodamin kanalını kullanarak mikrotübülleri bir floresan mikroskobu ile inceleyin.
Ardından, koruyucu kağıdı bant şeritlerinden çıkarın ve üç adet 10 mikrolitrelik hacimsel akış odası oluşturmak için şeritlerin üzerine silanize bir kapak kayması yerleştirin. Daha sonra, belirtilen reaktiflerin sıralı olarak eklenmesiyle kapak kaymasının avidin kaplamasını gerçekleştirin. Kapak kaymasını 80 mikrolitre genel tübülin tamponu ile yıkamadan önce üç ila beş dakika inkübe edin.
Daha sonra, akış odasına 20 mikrolitre mikrotübül yerleştirerek biyotinile mikrotübülleri b-BSA / avidin kaplı kapak kapaklarına takın. Kızakları, kapak kayması aşağı bakacak şekilde karanlık bir nem odasında oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra slaytları 200 mikrolitre genel tübülin tamponu ile yıkayın.
Daha sonra, 30 mikrolitre hareketlilik reaksiyonu karışımı uygulayın, ardından 20 mikrolitre motilite reaksiyon karışımında seyreltilmiş Cin8-GFP motorları akış odasına uygulayın ve hemen motorların mikrotübüller boyunca hareketini görüntülemeye devam edin. Motor hareketlilik görüntüleme için, mikroskop hedefine bir damla daldırma yağı yerleştirin, ardından akış odasını floresan mikroskop aşamasına, kapak kayması hedefe bakacak şekilde yerleştirin. Kapak kayma yüzeyine bağlı mikrotübüllere odaklanmak için rodamin kanalını açın.
Ardından, ImageJ Micro-Manager yazılımını kullanarak görüntüyü 20 milisaniyelik pozlama ile elde edin. Ardından, GFP kanalını açın ve bir saniyelik aralıklarla ve 800 milisaniyelik pozlamayla 90 hızlandırılmış görüntü elde edin. ImageJ Fiji yazılımında, hızlandırılmış filmi ve ilgili mikrotübül alan görüntüsünü açın.
Bu iki pencereyi Çözümle'yi, ardından Araçlar ve Windows'u Eşitle'yi seçerek eşitleyin. Bir kimografi elde etmek için, Parçalı Çizgi seçeneğini kullanarak bir mikrotübülü vurgulayın. Ardından, Analiz Et'ten Multi Kymograph sekmesini seçin.
Cin8-GFP moleküllerinin küme boyutunu belirlemek için, İşlem'e ve ardından Arka Planı Çıkar'a tıklayarak arka plan çıkarma ve eşit olmayan aydınlatma için düzeltme işlemlerini gerçekleştirin. Yuvarlanan top yarıçapını 100 piksele ayarlayın ve Sürgülü paraboloid seçeneğini işaretleyin. Ardından, ImageJ Fiji yazılımının TrackMate eklentisini kullanarak belirli bir hareketli olmayan Cin8-GFP motorunu izleyin.
Eklentiler'i, ardından İzleme, TrackMate, LoG dedektörü ve Basit LAP izleyiciyi seçerek Cin8-GFP motorunun ortalama floresan yoğunluğunu dört piksel yarıçaplı bir daire içinde zamanın bir fonksiyonu olarak izleyin. Farklı Cin8-GFP motorları için prosedürü tekrarladıktan sonra, floresan yoğunluklarını zamanın bir fonksiyonu olarak çizin. Daha sonra, Cin8-GFP moleküllerinin mikrotübül izleri boyunca hareketliliğini izlemek için, kaydedilen karelerin hızlandırılmış dizisinde analiz edilecek mikrotübülleri, dikdörtgen aracıyla vurgulayarak ve Görüntü'yü tıklatarak kırpın, ardından Kırp'ı tıklayın.
Analiz için bir floresan Cin8-GFP partikülü seçin. Noktasal aracı ve Ölçüm seçeneklerini kullanarak hızlandırılmış dizinin her karesindeki parçacık koordinatlarını kaydedin. Benzer şekilde, hızlandırılmış dizideki diğer floresan parçacıklar için koordinatları kaydedin.
Ardından, daha önce gösterildiği gibi, incelenen tüm Cin8-GFP parçacıklarına görünümlerinin ilk karesinde küme boyutu atayın. Daha sonra, belirtilen formülü ve belirlenen Cin8-GFP hareket koordinatlarını kullanarak, ilk koordinatlara göre her zaman noktasında Cin8-GFP'nin yer değiştirmelerini hesaplayın. Bu yer değiştirme değerlerinden, belirli bir Cin8-GFP parçacığı için olası tüm zaman aralıkları için yer değiştirmeyi hesaplayın.
İncelenen tüm Cin8-GFP parçacıkları için prosedürü tekrarlayın. Son olarak, incelenen tüm Cin8-GFP parçacıklarının zaman aralığına karşı ortalama yer değiştirmesini çizin ve doğrusal bir uyuma tabi tutun. Bu uyumun eğimi, hareketli Cin8-GFP parçacıklarının ortalama hızını temsil eder.
Tek mikrotübüller üzerinde farklı küme boyutlarındaki çift yönlü motor protein Cin8'in hareketlilik özellikleri burada gösterilmiştir. Her küme boyutu kategorisi için, kayıtlardan bireysel Cin8-GFP'nin 40'tan fazla yörüngesi çıkarıldı. Tek moleküllerin ve Cin8 motorlarının kümelerinin ortalama yer değiştirmelerini zaman aralığının bir fonksiyonu olarak çizmek, tek Cin8-GFP moleküllerinin yüksek hızda tek yönlü eksi uç-yönlendirilmiş bir şekilde hareket ettiğini göstermiştir.
Buna karşılık, Cin8 kümeleri daha düşük hız ve daha yüksek çift yönlü hareketlilik sergiler. Bu prosedürü uygularken, motor kümelenmesini etkileyebilecek kontaminasyonları önlemek için yüksek saflıkta motor proteini kullanılmalıdır. Motor floresan yoğunluğunu analiz ederken, fotobeyazlatmanın etkisinden kaçınmak için motorları göründükleri ilk çerçevede incelemek önemlidir.
Çift yönlü motorların hareketliliğini incelerken, motor kümelenmesi motor yönlülüğünü etkileyen temel faktörlerden biri olduğundan, tek molekülleri ve kümeleri ayrı ayrı analiz etmek son derece önemlidir.
