Bu protokol önemli, çünkü dinamik dengede olan nano ölçekli biyolojik sistemlerin tasarımında daha fazla araştırmanın önünü açıyor. Bu teknik, mühendislik ve doğal yapılar arasındaki boşluğun bir kısmını doldurur, çünkü kendi kendine iyileşen ya da moleküler bileşenlerin dinamik değişimi diyebileceğimiz şeyin incelenmesini sağlar. Bu tekniği ilk kez denemek için en önemli tavsiye, deneycinin tüm güvenlik protokollerini takip ettiğinden emin olmaktır.
İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi stok çözümlerini hazırlayın. Küçük bir mikro santrifüj tüp içine BRB80 Tampon Pipet 21.8 mikrolitre. Mikrotübül büyüme tamponu hazırlamayı bitirmek için magnezyum klorür stok çözeltisinin 1 mikrolitresini, GTP stok çözeltisinin 1 mikrolitresini ve DMSO stok çözeltisinin 1,2 mikrolitresini ekleyin.
Mikrotübül polimerizasyonuna başlamak için, 6.25 mikrolitre mikrotübül büyüme tamponunu doğrudan lyophilized tubulin 20 mikrogram lık aliquot içine ekleyin;647 nanometrede heyecanlanmak üzere etiketlendi. Girdap 40 RPS'de 5 saniye. 5 dakika buz üzerinde aliquot soğutun.
Sonra, 45 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka. Mikrotübül stabilizasyonuna başlamak için, 490 mikrolitre BRB80 tamponuna 5 mikrolitre aliquoted paclitaxel çözeltisi ekleyin. 10 saniye boyunca 30 RPS de çözelti girdap.
Mikrotübüller için 45 dakikalık kuluçka süresi dolduktan sonra, MT100 çözeltisini oluşturmak için BRB80'e bu çözeltinin 5 mikrolitresini ve paklitaksel karışımını ekleyin. İlk olarak, BRB80 tampon 291 mikrolitre aliquoted kazein çözeltisi 9.0 mikrolitre ekleyin. Yeni bir 6 mililitrelik mikro santrifüj tüp içine BRB80 kazein çözeltisi Pipet 83 mikrolitre.
D-glukoz, glikoz oksidaz, katalaz, DTT, kreatin fosfat ve fosfokiaz 1 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, hareketlilik çözeltisine stok ATP çözeltisinin 1 mikrolitresini ekleyin. Kimyasalları homojen bir şekilde dağıtmak için aliquot'u hareket ettirin veya girdap.
Daha sonra, motilite çözeltisine 1 mikrolitre hazırlanmış kinesin çözeltisi ekleyin, son konsantrasyon 20 nanomolar olacak şekilde. Motilite çözeltisine 10 mikrolitre MT100 çözeltisi ekleyin. Akış hücreleri için hem büyük bir kapak kayması hem de küçük bir kapak kayması kullanın.
Tüm kapakları iki kez etanol, iki kez de ultra saf suyla durulayın. Yıkanmış kapakları ultra saf suda 5 dakika sonicate. Daha sonra, 50 ila 75 santigrat derece arasında bir sıcaklıkta bir fırında kapakları kuru.
Oda sıcaklığında ve normal atmosferkoşullarında 15 dakika boyunca her kapak bir tarafı tedavi etmek için bir UV-ozon temizleyici kullanın. Cımbız kullanarak, her coverslip çevirmek ve de işlenmemiş tarafı tedavi etmek için UV-ozon kullanın. 5 dakika boyunca ultrasaf suda tedavi kapakları sonicate.
Daha sonra, 50 ila 75 santigrat derece arasında bir sıcaklıkta bir fırında kurutun. Daha sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi koruyucu giysiler don. Her coverslip'i tuzlu çözeltiye 15 saniye batırın.
Kapakları iki kez toluene, üç kez de metanolle yıkayın. Kapakları kurutmak için basınçlı azot kullanın. Kapaklar kuruduktan sonra, 2 santimetre ye 2,5 santimetre lik çift taraflı bant kesin.
2,5 santimetre şeritler tarafından iki 1 santimetre içine dikey olarak bu parçayı kesin. Hassas bir görev silecek üzerinde büyük kapak koymak ve bant şeritler iyelik sopa, bant parçaları arasında 1 santimetre 2,5 santimetre lik bir alan oluşturmak için kenarları boyunca uzun-bilge. Akış hücresi montajını tamamlamak için bant şeritlerinin üstüne küçük kapak lı yapıştırın.
İlk olarak, peg-PPG-PEG çözeltisinin yaklaşık 20 mikrolitresini monte edilmiş akış hücresine akıtın. Çözelti nin yüzeyde 5 dakika emmesine izin verin, daha sonra bu çözeltiyi tamponu üç kez akarak 20 mikrolitre BRB80 tamponu ile değiştirin. Akış hücresine hareketlilik çözeltisinin 20 mikrolitresini akış.
Bundan sonra, planlanan deney bir saatten uzunsa buharlaşmayı önlemek için akış hücresinin kenarlarını gresle kapatın. Görüntülemeyi nesnel tip total internal floresan mikroskopisi kullanarak gerçekleştirin. Hedefe bir damla daldırma yağı yerleştirin.
Daha sonra, akış hücresini mikroskop platformuna yerleştirin. Ve hedef ve akış hücresi üzerinde yağ arasında temas kadar objektif getirmek. Tüm lazer ışığının kaçmasını engellemek için mikroskobun kilitleme kapak sistemini kullanın.
Daha sonra, lazer açın ve mikrotübüller görüntü için 642 nanometre lazer kullanarak akış hücresinin alt yüzeyine odaklanmak, ve 488 nanometre lazer GFP kinesin motorları görüntü. İlgi çekici görüntüleri veya videoları kaydedin. Akış hücresinde hareketlilik olduğu sürece görüntüler kaydedilebilir.
Bu çalışmada, kendi yolunu inşa etmek için zayıf bağlayıcı yapı taşlarını biraraya getiren aktif bir nanoölçekli sistem sunulmuştur. Tirf mikroskobu kullanılarak, süzülen mikrotübüller kinesin motorlarından ayrı olarak görüntülenir. Mikrotübüller 647 nanometre lazer ile uyarma üzerine görülebilir.
Ve GFP kinesin bir 488 nanometre lazer ile heyecanlı zaman görülebilir. Uyarma ile kırmızı ve yeşil ışık arasındaki süre bir saniyeden azdı. Görüldüğü gibi, süzülen mikrotübüller çözeltiden kinesin motorlar birikir ve yüzeye yatırır.
Kinesin motorlar çözeltiye dönmeden önce kısa bir süre için mikrotübüllerin ardından kalır. Motilite çözeltisinin antifadesinde reaktiflerin doğru konsantrasyonunun olması çok önemlidir, aksi takdirde fotoğraf beyazlatma deneyin başarısız olmasına neden olur. Bu teknik, nano ölçekli mühendis sistemlerinde protein motorlarının daha verimli kullanılmasının önünü açmaktadır.
Böylece, daha karmaşık nanoyapıların tasarımı ve çalışmasını sağlar.
