3D çok renkli DNA FISH, korunmuş çekirdekler içinde birden fazla genomik loci görselleştirme belirsiz tek hücre düzeyinde karşılıklı etkileşim ve lokalizasyon tanımlamak için sağlar. 3D çok renkli DNA FISH nükleer mimarinin doğrudan araştırılmasını sağlar. Genel olarak, kromozom yakalama tabanlı teknolojiler ile birlikte çalışır tekniği tek hücreler içinde C veri doğrulama için kullanılabilir bir araç haline.
Prosedürü gösteren Federica Marasca olacaktır. Laboratuvarımda doktora sonrası. Başlangıç DNA materyalinin uzunluğuna göre 16 santigrat derecede bir termal mikserde nick çeviri karışımı kuluçka ile başlayın.
Kuluçka sonunda, %2.2 agarose jel üzerinde sondaların boyutunu kontrol edin. Her DNA FISH deneyi için, probların 150 mikrolitre çift distile su, 20 mikrogram etiketsiz somon sperm DNA'sı, 3,5 mikrogram türe özgü Cot-1 DNA'sı, üç cilt 100 etanol ve üç molar sodyumunun 1/10'uncu hacmini eksi 80 derece de bir saat boyunca bir saat boyunca ürettiği başlangıç DNA materyaline göre uygun miktarda prob çökeltin. Kuluçka sonunda, dört santigrat derece bir saat boyunca maksimum hızda örnek santrifüj.
Supernatant attıktan sonra, % 70 etanol 500 mikrolitre ile iki kez pelet yıkayın. İkinci yıkamadan sonra peleti %100 formamid'in iki mikrolitresinde yeniden askıya alın ve %20 dekstran sülfata eşit hacimde 4X tuzlu sodyum sitrat eklemeden önce prob'u 40 derecede 30 dakika sallayın. Küçük çekirdekli ve düşük miktarda sitoplazmalı küçük hücrelerin fiksasyon öncesi ve permeabilizasyonu için, ilk olarak 24 kuyulu bir plakanın tek tek kuyularında doğrudan 200 mikrolitre PBS'deki altıncı hücrelere iki kez 10 ekleyin ve hücrelerin oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yerleşmesine izin verin.
Kuluçka sonunda, hızlı bir şekilde 0.1% Tween 20 ile desteklenen taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit 300 mikrolitre ile PBS değiştirin. 10 dakika sonra, sabit hücreleri oda sıcaklığında yıkama başına beş dakika boyunca %0,05 TPBS'nin 300 mikrolitresinde üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, 300 mikrolitre ile T hücrelerini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 10 dakika boyunca permeabilize rnase kokteyli kuyusu başına 250 mikrolitre ile hücreleri tedavi etmeden önce 37 santigrat derecede bir saat pbs 1:100 seyreltilmiş.
Kuluçka sonunda, PBS 300 mikrolitre hücreleri durulayın ve dört santigrat derece bir gecede kuluçka ile her iyi PBS% 20 gliserol 300 mikrolitre ekleyin. Ertesi sabah, yavaş yavaş oda sıcaklığında örnekleri eritme ve 30 saniye PBS% 20 gliserol 300 mikrolitre onları ıslatma önce hücreleri dondurmak için 15 ila 30 saniye kuru buz üzerinde cam yerleştirin. Hücreleri üç kez daha dondurduktan/eritdikten sonra, numuneleri oda sıcaklığında %0,5 TPBS'nin 300 mikrolitresinde beş dakika yıkayın ve ardından oda sıcaklığında yıkama başına beş dakika boyunca %0,05 TPBS'nin 300 mikrolitresinde iki yıkama takip edin.
Son yıkamadan sonra, hücreleri oda sıcaklığında 12 dakika boyunca 0,1 normal hidroklorik asit 300 mikrolitre ile tedavi, tuzlu sodyum sitrat 300 mikrolitre iki durulama takip. Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında 2X tuzlu sodyum sitratta %50 formamidin 300 mikrolitresinde bir gecede düzeltin. Fiksasyon için, sitoplazma yüksek miktarda büyük hücrelerin permeabilization, düzeltmek, ön-tedavi ve insan birincil T hücreleri için gösterildiği gibi hücreleri benzer permeabilize ve 0,0025% pepsin 300 mikrolitre ile örnekleri tedavi 0.01 normal hidroklorik asit birkaç saniye için beş dakika.
Bir optik mikroskop altında hücreleri gözlemleyin ve çekirdekleri sitoplazma dan serbest ama çekirdekleri hala görünür ve bozulmamış en kısa sürede 50 milimolar magnezyum klorür 300 mikrolitre iki beş dakikalık yıkayArak reaksiyonu durdurmak. 3D çok renkli DNA FISH için, melezleme problarını 80 santigrat derecede beş dakika boyunca denatüre edin ve sondaları hemen buza yerleştirin. Probları temiz bir mikroskop slaytına yükleyin ve her bir prob damlasına bir kapak kayması yerleştirin.
Kapak kenarlarını kauçuk çimento ile kapatın. Çimento tamamen kuruduğunda, numuneleri 75 derecelik bir ısıtma bloğunda denatüre edin. Dört dakika sonra, bir su banyosunda yüzen metalik bir kutu da bir gecede 37 santigrat derece örnekleri hydridize.
Ertesi sabah, kauçuk çimento soyma ve 2X tuzlu sodyum sitrat batırılmış slaytlar ile dikkatlice kapakları kaldırın. Her coverslip'i, dakikada 90 devirde sallayarak 37 derecede iki beş dakikalık yıkamalar için kuyu başına iki mililitre taze tuzlu sodyum sitrat içeren altı kuyulu bir plakanın ayrı kuyularına yerleştirin. Kuluçka sonunda, 4X tuzlu sodyum sitrat içinde 0,2% Tween 20 iki mililitre kapakları kısa bir süre durular.
3D çok renkli DNA FISH algılaması için, kapakları yeni bir 24 kuyuplakasının tek tek kuyularına aktarın ve 300 mikrolitre lik blokaj tamponunda 37 santigrat derecede 20 dakika ve dakikada 20 devirde spesifik olmayan bağlanmayı engelleyin. Kuluçka sonunda, 37 santigrat derece karanlık ve ıslak bir odada 35 dakika boyunca tampon engelleme seyreltilmiş anti-digoksigenin ve / veya streptavidin uygun konsantrasyonu ile örnekleri tedavi. Kuluçka sonunda, örnekleri altı kuyulu bir plakanın ayrı kuyularına aktarın ve numuneleri dakikada 90 devirde sallayarak yıkama başına beş dakika boyunca %0,2'lik Tween 20 ve 4X tuzlu sodyum sitrat olmak üzere iki mililitrede üç kez yıkayın.
Son yıkamadan sonra, kapakları oda sıcaklığında iki dakika boyunca pbs'de %2 formaldehit in 300 mikrolitrelik formaldehit tesbiti için 24 kuyulu yeni bir plakaya aktarmadan önce numuneleri iki mililitre PBS cinsinden dengeleyin. Sabit hücreleri 300 mikrolitre PBS'de beş kez kısa bir süre yıkayın ve ardından dapi ile mililitre başına bir nanogramda 300 mikrolitre PBS ile oda sıcaklığında beş dakika boyunca seyreltildi. Kapakları PBS'de beş kez daha yıkayın ve numuneleri uygun bir montaj ortamıyla monte edin.
Sonra bir mikroskop sistemi ile 3D görüntüler elde. 3D çok renkli DNA FISH korunmuş 3D çekirdekleri içinde farklı genomik loci çağdaş görselleştirme sağlar. DNA sondası hazırlama için, 200'den az baz çifti bir sonda boyutu başarılı bir 3D çok renkli DNA FISH prosedürü sağlar.
Nick çevirisi ile üretilen suboptimal DNA FISH probları kısmen veya fazla sindirilebilir. Sindirilmiş problar üzerinde hibridizasyon özgüllük kaybı ve arka plan sonucu bir artış nedeniyle nonspesifik bir sinyal neden olacaktır. İnsan birincil T lenfositler ve küçük çekirdekleri ve sitoplazma düşük miktarda küçük hücreler için, 12 dakikalık 0.1 normal hidroklorik asit tedavisi DNA probları için çekirdek erişilebilirliğini teşvik etmek ve nükleer bütünlüğü korumak için tavsiye edilir.
Sitoplazmik pepsin sindirim küçük hücrelerde bir DNA FISH iyi sinyal elde etmek için gerekli değildir. Ancak, insan birincil miyoblastlar ve büyük çekirdekleri ve bol sitoplazmaya sahip hücreler için pepsinizasyon adımı esastır. Kısa ve suboptimal sitoiskelet pepsinizasyonu dna FISH sinyali yokluğunda biten çekirdekiçine prob girişini engelleyecektir.
Ancak, hücreler pepse üzerinde ise, çekirdekleri 3D yapısını kaybetme bozulmadan kalmaz. Başarılı bir 3D çok renkli DNA FISH çekirdekleri içinde sinyal varlığı neden olacaktır. Ben taze biyolojik malzeme ile çalışma öneririz, 3D çok renkli DNA FISH gerçekleştirmeden önce probları test, taze çözümler hazırlama ve kuluçka süreleri ve sıcaklıklar ile hassas olmak.
Formamid ve HCL'nin tehlikeli maddeler olduğunu ve her zaman uygun tek kullanımlık malzemelerle kimyasal gaz kaputunda kullanılması gerektiğini unutmayın.
