R01NS064593 ve R21ES016636 (KV) tarafından kısmen desteklenir. Mikroskopi VCU yapıldı - Nörobiyoloji &amp; Anatomi Mikroskopi Tesis Bölümü, NIH-NINDS Merkezi çekirdek hibe 5P30NS047463 fon ile, kısmen desteklenmektedir. Dönen diske konfokal mikroskop bir NIH-NCRR ödülü (1S10RR027957) ile satın alınmıştır.

A. Hücre Hazırlanması <ol><li> Normal insan primer fibroblast (GM02270) Coriell Hücre Deposu, Camden, New Jersey, elde ve hTERT 6 ile ölümsüzleştirdi edilmiştir. Hücreler CellStar yetiştirilen ve genişletilmiştir% 20 fetal bovin serumu (Gibco), non-essential/essential amino asitler, vitaminler, sodyum piruvat, ve penisilin / streptomisin (HyClone ile desteklenmiş MEM oluşan ortam içinde, 6 cm tabaklar (4 ml) ). </li><li> İnsan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücreleri, American Type Culture Collection&#39;dan temin edilebilir ve CellStar 6 cm tabaklar içinde yetiştirilen ve genişletilmiştir. Hücreler,% 10 fetal bovin serumu, zaruri olmayan amino asitler, L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM, ve penisilin / streptomisin içeren ortam (4 mi) içinde tutuldu. </li><li> 53BP1-mCherry (N-myc-53BP1 WT pLPC-Puro; Addgene plazmid 19836) ve H2B-GFP (pCLNR-H2BG; Addgene plazmid 17735) füzyon geni de puromisin veya G418 direnç genleri ifade yapıları, sırasıyla, (fibrobla transdüklü edildiSTS) ya da transfekte (HEK293) hücrelerin içine SuperFect (Qiagene) kullanarak ve ilaç seçimi altında yapılmaktadır. Floresans Bakım periyodik olarak kontrol edildi. </li><li> 24-48 saat görüntü elde etme önce, hücreleri tek bir hücre süspansiyonu içine tripsinize edildi ve 3,5 cm FluroDish cam alt plakalar üzerine düşük bir yoğunlukta ekildi. </li></ol> B. Mikroskop Kurulum ve Image Acquisition Bu protokol bir AxioObserver Z1 standı, çift kanallı Yokagawa CSU-X1A 5000 iplik disk birimi, 2 Fotometrik QuantEM 512SC emCCD kameralar, bir HXP 120C fiber tabanlı aydınlatıcı, 4 ile donatılmış Zeiss Cep Gözlemci SD iplik diski konfokal mikroskop kullanılarak geliştirilmiştir lazerler (Bir Lasos 100mW multi-line Argon [458, 488, 514 nm], 50 mW 405 nm diyot, 40 mW 561 nm diyot, ve 30 mW 635 nm diyot), AOTF bir Pecon XL multiS1 sahne kuluçka sistemi, Zeiss inkübasyon modülleri (O 2 Modül S, CO 2 Modül G, TempModule S, Isıtma Ünitesi XL S) ve Geçmiş moBir NanoScanZ piezo Z ekiyle torized XY tablası. Görüntüleme canlı hücreleri sulu bir ortamda, bir C-Apochromat 63x/1.20 Su / Corr objektif lens ve Zeiss İmmersol W daldırma sıvısı (bir kırılma indisi n = 1.334) ile desteklenir ise küresel sapmaları en aza indirmek için kullanılmıştır. 2 kanal konfokal görüntüleme, bir RQFT 405/488/568/647 dikroik ayna ve BP525/50 (yeşil) ve BP629/62 için (kırmızı) emisyon filtresi kullanılmıştır. Kullanılan sistem yazılımı AV4 Multi-channel/Z/T, Hızlı Görüntüleme, Fizyoloji, Mosaix, Mark &amp; ​​Bul, Çift Kamera, 4D İçeride, Otofokus ve 3-D Dekonvolüsyon modülleri ile Zeiss Axiovision (vers. 4.8.2.0) idi. <ol><li> O CO 2 gazı kuluçka sisteminin CO 2 Modül için çalışıyor olduğundan emin olun. Mikroskop bir anti-titreşim hava tablo tarafından destekleniyorsa, hava tablo için hava beslemesi (veya N 2 gazı) açın. </li><li> Iplik disk birimi, kameralar, kuluçka modülleri, HXP aydınlatıcı, motorlu sahne, Argon, mikroskop standı için gücü açınlazer ve bilgisayar. </li><li> Isınma süresi 1 dakika sonra, &quot;On&quot; Argon lazer için kontak anahtarını açın. </li><li> Zeiss lazer kontrol panelinde kullanılacak lazer çizgileri için anahtarları açın. </li><li> &quot;Lazer run&quot; için &quot;bekleme&quot; dan Lasos Argon lazer denetleyicisi için geçiş anahtarı açın ve optimum düzeyde (sadece aşağıdaki yani yeşil gösterge kırmızı yanar noktası) ışık denetleyicisi ayarlayın. </li><li> AxioVision yazılımını başlatın Not:. AxioVision için kullanıcı arayüzü, denetlediği özel mikroskop ve bileşenler için belirli olan pencere ve açılan menüleri ile özelleştirilmiş olabilir. Bunun gibi, her sistem potansiyel olarak benzersiz bir arayüze sahiptir. Bu nedenle, yazılım manipülasyonu için genel talimatlar yerine özel yazılım pencereler, sekmeler ve / veya açılır menüler için yön daha sonraki adımlarda verilmiştir. </li><li> Görüntüleme öncesinde yaklaşık 1 saat, yazılım, kuvöz için denetimlerini bulmak veüst kamara ve sahne plaka ısıtma açın. 37 ° C&#39;ye sıcaklığı ayarlayın CO 2 kontrol açın ve% 5 seviyesini ayarlayın. </li><li> Görüntüleme için objektif lens seçin. Bu çalışmada, bir 63x/1.20 NA C-Apochromat Su / Corr objektif lens kullanılmıştır Not:. Bu lens için, su (Zeiss İmmersol B daldırma sıvı) &#39;e benzer bir kırılma indisi olan bir daldırma ortamı ihtiyaç vardır. </li><li> Birden fazla ayrı konumları, uzun bir süre boyunca örneklenmesi için ise, bu bir konumdan diğerine yapılmasını sağlamak için daldırma orta yeterli bir miktarı uygulamak için emin olmak. </li><li> Sahnede çanak yerleştirin ve alt temas objektif lens getirmek. </li><li> Mikroskop denetimleri veya yazılımı kullanarak, göz mercekleri için yaydığı ışığın yönlendirmek ve uygun Widefield filtre ilgi floresan sinyal (bu çalışma için, &quot;Kırmızı&quot; filtresi 53BP1 ve &quot;GFP&quot; filtre için ayarlanan H2B için belirlenen için belirlenen seçin ). &lt;/ Li&gt; <li> , Oküler lensler sayesinde görüntüle Görüntüyü odaklamak ve hücrelerin uygun bir alan bulun. </li><li> Yazılım veya mikroskop denetimlerini kullanarak, konfokal dönen disk ünitesi ile bağlantı noktasına okuler dan yayılan ışık uzak yönlendirmek. </li><li> Yazılım, uygun lazer (Bu çalışmada, 53BP1 için 561 nm lazer ve H2B için Argon lazer 488 nm hattı için) açın. </li><li> Her kanal için uygun bir seviyeye acousto-optik ayarlanabilir filtre (AOTF) kontrol ayarlayarak lazer yoğunluğunu ayarlayın. </li><li> Uygun dikroik ayna (RQFT 405/488/568/647) ve emisyon filtresi (H2B için 53BP1 ve BP 525/50 BP 629/62) seçin. Dönen disk ünitesi için deklanşör açın. </li><li> Görüş mevcut alanı görüntülemek için &quot;Canlı&quot; penceresini seçin. </li><li> Yazılımda, &quot;Kamera&quot; kontrol açmak, kamera (çift kamera sistemi varsa) kullanılacak seçin ve yaklaşık 100 ms pozlama süresini ayarlayın. % Ayarlayın ve EM kazanmak yerde sınıflandırılmamış olarak. Gerekli veri Not: 53BP1-mCherry yapı biraz loş görünür. Biz EM kazancı artırmak için yararlı buldu. </li><li> Yazılımda, konfokal dönen disk ünitesi için kontrol panelini açmak ve uygun bir görüntü (örneğin ~ 100 ms) yakalamak için kuruldu kamera pozlama süresini girerek dönen disk hızını ayarlayabilirsiniz. Değişiklik kilitlemek için &quot;Set&quot; i tıklayın. </li><li> &quot;Çok boyutlu kazanım&quot; açın. Kanal sekmesini seçin ve yük / uygun kanalları seçmek. Bu araştırma için, DsRed (561 nm lazer uyarma ve BP 629 / emisyon için 62 filtre) ve GFP (eksitasyon ve emisyon için BP525/50 filtresi için 488 nm lazer hattı) için tanımlanan kanalları kullanarak ediyoruz. </li><li> Görüntü kaydı sağlamak için, ortak bir dikroik ayna (RQFT 405/488/568/647) iki kanal için kullanılmıştır. &quot;Otofokus&quot; için yazılım ayarlayın Not:. MDA ayarlarını yapmak için Araçlar → Ayarlar editörü gidin. Yeterli lazer güç (&quot;Yeterli lazer güç&quot; sağlayan bir etken olarak ayarlandığından emin olunfoto-ağartma azaltırken) uygun fluorofor heyecanlandırmak için. </li><li> MDA penceresinde, z-yığını sekmesini seçin. &quot;Z-yığın geçerli odak konumda&quot; seçeneğini seçin. Z-yığınının tam boyutu hücre yükseklik bağlıdır: ~ 10 mikron z-yığını ve Z. Not yoluyla Nyquist örnekleme sağlamak için adım sayısı için &quot;optimum&quot; seçmek için aralığı ayarlayın. Buna göre ayarlayın. </li><li> 23. &quot;Başlat&quot; ve ayarları soruşturma ne uygun olmasını sağlamak için çıkan z-yığın görüntüyü analiz tıklayın (örn. Bu çalışmada, bu görüntü tüm çekirdeğine önemliydi). </li><li> &quot;T&quot; (zaman) sekmesini seçin. Kamptotesin ile denemeniz için, 5 dakika ve bir kontrol (arıtılmamış hücreleri) video için 1 saat için oturumun toplam süresi görüntüleme zaman noktalarında arasındaki süreyi ayarlamak Not:. Hücrelerinin fotoğraf beyazlatma en aza indirmek için, deney yapılandırılmış olması gerekir gibi görüntüleme zamanı noktaları arasındaki AOTF boşlukları lazer olduğunu. </li><li> Fveya çanak çeşitli hücrelerin çoklu nokta görüntüleme, MDA penceresinde, pozisyon sekmesini seçin. Kontrol edilir &quot;başına konum &#39;zaman noktasında önce / sonra ayar&#39; Uygula&quot;. Olun &quot;Mark_Find&quot; seçeneğini seçin. &quot;Canlı&quot; görünümünü kullanarak, etrafında hareket ettirin ve görünümü uygun alanları seçin. </li><li> Deneme başlayacak ve (işlenmemiş hücrelerin) bir kontrol video kaydetmek için çok boyutlu edinme menüden &quot;Başlat&quot; a tıklayın. </li><li> Kontrolü video sonra, uygun işlem (Bu durumda, 10 uM kamptotesin içinde) ilave edin. Biz 2-4 saat için 5-10 dk aralıklarla deneysel (ilaçla tedavi hücreleri) video kaydı Not:. Dikkate almak önemli bir konu, belirli bir etkisi tedavi sonrası meydana geldiği ile hızıdır. Video da görüldüğü gibi, 53BP1 odakları CPT eklenmesinden sonra ~ 5 dk başlar. Nispeten kolay bir süreç, elle çanak ilaç ekleyerek ve mikroskop yeniden kalibre zaman alıyor olsa. Deneyler tasarlarken göz önünde bulundurulması Bu verilmelidir. </li><li> M izlenmesi içinitosis, biz 7.5 dk aralığını ayarlayabilir ve 4-5 saat (belirli ayarları kullanılan hücre dizisi ve onun hücre döngüsünün süresine bağlıdır) kaydedildi. Ayarlamalar uzun kayıt sırasında foto-ağartma önlemek için yapılması gerekebilir. </li></ol> C. Görüntü İşleme ve Analizi Bu protokol Volocity yazılımı (Perkin Elmer) kullanılarak geliştirildi. Bu veriler (AxioVision) elde etmek için kullanılan yazılım aynı zamanda görüntü işleme ve analiz yeteneğine sahiptir. Kullanıcılar kendilerine sunulan yazılımları kullanabilir ve bunların uygulanmasına ilişkin ilgili literatür danışmak için teşvik edilir. <ol><li> Volocity yazılımını açın. Oluşturun ve yeni bir kütüphane adlandırın ve video dosyalarını içe. </li><li> Dosyalarını görüntülemek için, biz genellikle &quot;Genişletilmiş Odak&quot; ayarını kullanmak için en yararlı buluyorum. Bu z-yığını dilimleri üst üste bindirir ve bu protokol için, bize çekirdeğin farklı alanlarda 53BP1 odaklar görüntülemenizi sağlar. </li><li> Gerektiğinde videoları ayarlayın. Volocity alınan görüntülerin kalitesini artırmak için bir araç yelpazesi ile donatılmıştır. Mikroskop ayarlarının uygun olduğunu sağlayarak, çok zaman sonra düzenleme kaydedilebilir. Çoğu zaman, bu görüntüleri deconvolve ve parlaklık / kontrast ayarlamak için yardımcı olur. Sizin özel düzenleme ihtiyaçları deneye dayanan değişecektir. </li><li> Göreli bir zaman damgası ve ölçek çubuğu ekleyin. </li><li> 3-D hücreleri görüntülemek için, &quot;3-D Saydamlık&quot; ayarına getirin. Bu nedenle hücre içinde ilgi yapıların farklı bakış açıları sağlayarak, uzayda 3 boyutlu render hücrelerin rotasyonu verir Not:. It belirlemek için farklı düzlemlerde hücreleri görselleştirmek için yardımcı olduğu faiz seyahat yapıları. Örneğin, &quot;Genişletilmiş Focus&quot; bir ortamda bu 53BP1, aslında, mitoz sırasında DNA dan ayrıştırmak olmadığını anlamak için zordur. Ancak, bu 3-D kolayca görülmektedir. </li><li> Filmler ve hareketsiz görüntüler kullanıcı tercihlerine göre dosya türleri çeşitli içine ihraç edilebilir. </l<html> i&gt; </ol> D. Temsilcisi Sonuçlar CPT yanıt olarak 53BP1 odak oluşumu bir örneği Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Hücreler 5-10 dk içinde CPT formu odaklar maruz, ve kayıt süresi boyunca bu odaklar korumak. Gibi yoğuşmalı kromozomların etrafında ince bir sis oluşturarak, Şekil 2, mitoz başlangıcında kromatin adlı 53BP1 dissosiye gösterilmiştir. Telofaz oluşur ve mitoz sona gelince, farklı odaklar haline 53BP1 tekrar agregalar. HEK293 hücreleri CPT maruz kalmamış olsa da, yine de endojen DNA hasarı tarafından üretilen bol, spontan 53BP1 onarım odakları oluşur. Bu gözlem bizi 53BP1 iyonizan radyasyon ve radyomimetik ilaçlar 5 hücrelerin maruz kaldıktan sonra benzer bir etki gösteren bir önceki raporu doğrultusunda, erken mitoz sırasında odak teşkil etmemektedir sonucuna izin. ure 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. Kamptotesin (10 uM) DSBs ve orta için ilaç ekleme 30 dakika içerisinde fibroblastlar döngüsünde 53BP1 odaklar oluşumuna neden olur. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> Şekil 2. 53BP1 HEK293 hücrelerinde telophase/G1 kadar mitoz sırasında odaklar oluşturmaz.

<ol>
	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).</li><li>Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fluorescence+imaging+of+live+cells+by+effective+cytosolic+delivery+of+probes.">Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes.</a> PLoS One. 5, e10459 (2010).</li><li>Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Genomik bütünlüğünün korunması hücrenin yaşaması için önemlidir. Erken yaşlanma, karsinogenez veya ölüm 8 genom sonuçları korumak için başarısızlık. Sezmek yoğun ilgi var nasıl temel ve klinik hem de araştırma için önemini kaynaklanan DDR fonksiyonları. Birçok teknikleri hücreleri algılamak ve DNA hasarı onarmak nasıl çalışmaya yardımcı olmak için yıllar içinde geliştirilmiştir. Teknolojideki son gelişmeler giderek daha sofistike yöntemler gelişmeye izin olsa blo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Ürün </td><td> Şirket </td></tr><tr><td> CellStar kültür tabaklarında </td><td> Greiner Bio-one </td></tr><tr><td> FluroDish cam alt yemekler </td><td> Dünya Precision Instruments, Inc </td></tr><tr><td> MEM ortam </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Non-esansiyel amino asitler </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Amino asitler </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitaminler </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Sodyum piruvat </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; plasmid 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss Cep Gözlemci SD Görüntüleme sistemi </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (sürüm 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss İmmersol W Yağı </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity yazılımı (sürüm 6.0) </td><td> Perkin Elmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

Çift iplikli sonları (DSBs) en zararlı DNA olan bir hücre karşılaşabilirsiniz Lezyon. Onarılamayan bırakılırsa, DSBs liman büyük potansiyel mutasyonlar ve kromozomal anomaliler 1. üretmek. DSBs algılamak için hücreler, DNA hasar cevabı (DDR) etkinleştirmek ve DNA tamir için genomik instabilite katalizleyen bu travma önlemek için çok önemlidir. Uyarıldığında, DDR onarım gerçekleşecek ya da apoptoz geçmesi hücre zorlamak için izin vermek için hücre döngüsü tutuklama tetikleyerek genomik bütünlüğünü korumak için çalışır. DSB onarım baskın mekanizmaları nonhomologous sonu katılmadan (NHEJ) ve homolog rekombinasyon tamiri (HRR) (2 yorum) yoluyla meydana gelir. Olan faaliyetleri kesin DDR düzgün çalışması için düzenledi gereken pek çok protein vardır. Ve bu proteinlerin birinin, 53BP1 3-boyutlu (D) görselleştirme - Burada, bir 2 için yöntem açıklanmaktadır. P53-bağlayıcı protein 1 (53BP1) alanlarına lokalize5-15 dakika 5 içinde odaklarının oluşturulması, modifiye histon 3,4 bağlanarak DSBs. DSB sitelerine 53BP1 ve diğer DDR proteinlerin histon modifikasyonlar ve alım hasar bölgelerinin çevresinde kromatin yapısal yeniden düzenlenmesini kolaylaştırmak ve DNA tamir 6 katkıda bulunduğuna inanılmaktadır. Tamir doğrudan katılım da ötesinde, ilave rollerin, bir intra-S kapısı, bir G2 / M kontrol noktası, düzenleyici ve aşağı doğru DDR proteinleri 7-9 aktive olduğu gibi, DDR de 53BP1 için tarif edilmiştir. Son zamanlarda, 53BP1 yerine DSBs 6 civarına lokalize önce G1 girmek hücreleri bekliyor, mitoz sırasında indüklenen DNA hasarına yanıt olarak odaklar teşkil etmemektedir keşfedilmiştir. Bu tür 53BP1 gibi DDR proteinleri mitoz ile 10 arasındaki ilerlemesi esnasında mitotik yapılar (kinetochores gibi) ile ilişkilendirmek için tespit edilmiştir. Bu protokolü biz 2 kullanılmasını tanımlamak - ve 3-D canlı hücre görüntüleme görselleştirmek içinDNA hasarına neden olan ajan kamptotesin (CPT) yanı sıra, mitoz sırasında 53BP1 davranışı yanıt olarak 53BP1 odaklarının oluşumu. Kamptotesin öncelikle DNA replikasyonu sırasında DSBs neden ben inhibitörü bir topoizomeraz olduğunu. Bunu başarmak için, biz daha önce açıklanan 53BP1-mCherry floresan füzyon proteini DSBs 11 bağlamak mümkün bir 53BP1 proteinin etki oluşan inşa kullanılır. Buna ek olarak, bir histon H2B-GFP füzyon proteini floresan mitoz sırasında 12 hücre döngüsü boyunca ama özellikle kromatin dinamik izlemek mümkün yapı kullanılır. Birden fazla boyutta canlı hücre görüntüleme ökaryotik hücrelerde DDR proteinlerin fonksiyonu anlayışımızı derinleştirmek için mükemmel bir araçtır.

Watch this Scientific Journal Video about Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins at JoVE.com

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Bu protokol, DNA hasarının yanı sıra, mitoz sırasında lokalizasyonu cevap olarak aktive bir çift iplikli DNA mola sinyal protein görüntülenmesi için bir yöntem açıklanır.

DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

two-three-dimensional-live-cell-imaging-dna-damage-response

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Görüntüleme.  Virginia Commonwealth University. Bu protokol, DNA hasarının yanı sıra, mitoz sırasında lokalizasyonu cevap olarak aktive bir çift iplikli DNA mola sinyal protein görüntülenmesi için bir yöntem açıklanır.

Video: Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Üç boyutlu Hücre ekimi için Chip-ölçekli Yapı iskeleleri mikroimalat

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Biyoloji

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Canlı Hücre Görüntüleme için SNAP-tag Fusion Proteinler ifade COS-7 Floresan Etiketleme

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Bozulmamış Organoidlerin Tek Hücreli Çözünürlükte Üç Boyutlu Görüntülemesi

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine. To fully exploit these models, it is crucial to study them at cellular and subcellular levels. However, characterizing such in vitro 3D cell culture models can be technically challenging and requires specific expertise to perform effective analyses. Here, this paper provides detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed in vitro 3D cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters. These protocols are applicable to a wide variety of organoids and spheroids that differ in their cell-of-origin, morphology, and culture conditions. From 3D structure harvesting to image analysis, these protocols can be completed within 4-5 days. Briefly, 3D structures are collected, fixed, and can then be processed either through paraffin-embedding and histological/immunohistochemical staining, or directly immunolabeled and prepared for optical clearing and 3D reconstruction (200 &#181;m depth) by confocal microscopy.

Here, we provide detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed three-dimensional cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters, thus enabling the visualization of their morphology, cell-type composition, and interactions.

Üç Boyutlu Organoid ve Küresel Modellerin Boyama ve Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

DNA Çift Telli Molalarda Transkripsiyonal Aktivitenin Canlı Hücre Görüntülemesi

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...