Bu protokol önemlidir, çünkü gelişmekte olan bir balıktaki genlerin devrilmesine ve aşırı ifade edilmesine ve bu aşağı akış etkilerinin kan hücreleri üzerindeki nicelliğini sağlar. Bu protokol hızlı, gerçekleştirilmesi kolay, ekonomik ve uygun enstrümantasyona erişimle otomatikleştirilmesi kolaydır. Bu prosedürü laboratuvarda lisans araştırmacısı kristen Rueb gösterecektir.
Döllenme embriyolarından sonra beş ila 200, 48 saat arasında plastik 10 santimetrelik bir Petri kabına transfer ederek başlayın. Embriyonun alt kenara batması için kabı eğin ve tabaktan mümkün olduğunca fazla E3 ortamı çıkarın. Daha sonra embriyolara 500 mikrolitre kaynatma proteaz ekleyin.
Oda sıcaklığında beş dakika sonra, tüm embriyoları plakanın alt kenarına tekrar ucun ve kabın kenarına hafifçe dokunun, embriyoların korozyonlarını tamamen çıkarmak için plakanın altına hafifçe sürtünmesine izin verin. Bir sıkma şişesi kullanarak proteazı seyreltmek ve embriyoların yerleşmesine izin vermek için yaklaşık 20 mililitre E3 ortamı ekleyin. Daha sonra ortamı deklare edin ve embriyoları proteazın tüm izlerini gidermek için gösterildiği gibi taze ortamla üç kez daha durulayın.
Embriyoları ayrışmaya hazırlamak için, beş ila 10 embriyoyu bir, 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpüne aktarmak ve aktarılan E3 ortamını aspire etmek için bir P1000 pipet kullanın. Daha sonra embriyonik zebra balığına E3 ortamında bir mililitre 10 milimolar DTT ekleyin ve mukus kaplamasını çıkarmak için mikrosantrifüj tüpünü oda sıcaklığında 30 dakika yatay bir konuma yerleştirin. Embriyo ayrışması için, DTT tedavi edilen embriyoları yıkama başına kalsiyum ve magnezyum ile desteklenmiş bir mililitre DPBS ile üç kez yıkayın.
Kalsiyum ve magnezyum ile desteklenmiş 500 mikrolitre DPBS ve mililitre başına beş miligram beş mikrolitre eklemeden önce, ayrışma proteaz. Daha sonra örnekleri 37 santigrat derecede yatay bir yörüngesel çalkalayıcıda dakikada 185 devirde 60 dakika kuluçkaya yatırın. Embriyoları periyodik olarak kontrol ettiğinizden emin olun, böylece onları fazla sindirmeyin.
Bazı katı dokulara sahip tamamen homojen olmayan bir örnek gözlenebildiğinde, embriyoları bir P1000 pipeti ile numune tamamen dağılana kadar tritüre edin. Ayrışmış zebra balığı embriyonik hücrelerini akış sitometrisi için hazırlamak için, tüm hücre örneğini 35 mikrometre hücre süzgeç kapağı ile beş mililitre polistiren yuvarlak alt tüpün üst rezervuarına aktarın. Kapağı kalsiyum veya magnezyum olmadan dört mililitre PBS ile durulayın ve hücreleri santrifüjleme ile peletlayın.
Daha sonra hücreleri tüp başına kalsiyum ve magnezyum olmadan 500 mikrolitre PBS'de yeniden biriktirin. Zebra balığı embriyonik hücrelerinin akış sitometrik analizi için, her tüpe bir ila bin kırmızı ölü hücre lekesi seyreltme eklemeden önce hücre süspansiyonlarını hafifçe girdaplayın. Ölü hücre lekesini uyguladıktan sonraki 30 dakika içinde atık tankını boşaltın, kılıf tankını uygun çözelti ile doldurun ve akış sitometresinin akışkan sistemini başlatın.
Analiz yazılımında, beş çizim yapın ve ilk çizimi öne doğru ve yan dağılım ölçülecek şekilde ayarlayın. İleri dağılımını doğrusal, yan dağılımını logaritmik olarak ayarlayın. İkinci çizimi, ileri dağılım genişliğine karşı ileri dağılım yüksekliğini ve üçüncü çizimi dağılım yüksekliği ile yan dağılım genişliğini ölçmek için ayarlayın.
X eksenindeki kırmızı ölü hücre lekesini ölçmek için dördüncü çizimi ayarlayın ve ölü hücrelerden canlı ayrımcılığına izin vermek için y ekseninde yan dağılım. Beşinci arsa, seçim flororore ölçmek için ayarlanmalıdır. Tüm çizimler ayarlandığında, örneği sitometreye yükleyin ve hücrelerin hızlı bir şekilde tükenmemesi için akış hızını azaltın.
Hücre popülasyonunun büyük kısmının net bir şekilde gözlemlenebilmesi için ileri ve yan dağılım ayarlarını yapın ve hücre popülasyonunun etrafına bir kapı çizin. Bu kapı hücrelerini etiketle. Hücrelere kapılı ikinci nokta çizimi ile, ileri saçılım üzerindeki kapı ve çiftleri dışlamak için yan dağılım singlet'ları.
Dördüncü çizimde, kırmızı ölü hücre lekesi ayarlarını açıkça negatif bir popülasyon olacak şekilde ayarlayın. Bu hücrelerin etrafına bir kapı çizin ve bu kapıyı canlı hücreler olarak etiketle. Beşinci çizimde, canlı hücrelere kapı verin ve pozitif hücrelerin etrafına bir kapı çizin, ardından en az 25.000 canlı hücre olayı toplayan her örneği çalıştırın.
Tüm numuneler analiz edildiğinde, akışkanları kapatmak, kılıf tankını doldurmak ve atık tankını boşaltmak için kapatma prosedürünü izleyin. Her embriyonik zebra balığı örneğinden GFP pozitif kırmızı kan hücrelerinin yüzdesi analiz edildikten sonra, tüm kontrol grubunun ortalaması hesaplanabilir. Genellikle, ortalama bir olarak ayarlanır ve yüzdelerin tümü bu referans noktasından hesaplanır.
Bu temsili analizde, ISM1 transkriptinin spesifik bir morfoin ile azaltılmasının, döllenme embriyolarından sonraki 48 saat içinde mevcut GFP pozitif kırmızı kan hücrelerinin sayısını azalttığı belirlenmiştir. ISM1 morfotino seviyelerindeki bu azalmayı eksojen mRNA ile kurtarmak, kırmızı kan hücrelerinin sayısını normale döndürür. Numunelerde uygun sindirim çok önemlidir.
Aşırı sindirirseniz veya az sindirirseniz, doğru sonuçları alamazsınız. Bir faks makinesi varsa, araştırmacılar in vitro kültür, RNA dizilimi ve nicel RT-PCR için sıralayarak kan hücrelerini toplayabilirler.
