Bu protokol, embriyonik gelişimi düzenleyen mikroRNA'ların profilini doğru bir şekilde ortaya koymak için erken embriyolardan düşük girdi, küçük RNA sıralama kitaplıklarının hazırlanmasını basitleştirmeyi amaçlamaktadır. Bu tekniğin avantajı, düşük giriş örneklerinin biraraya getirmekten kaçınmasıdır ve hem sıralanmış hem de sıralanmış hücrelere kolayca uygulanabilir. Ayrıca, kopyalar arasındaki varyantları önlemek için dikkatli embriyo evreleme göstermek.
Bu yöntem, girdi RNA konsantrasyonlarının düşük olduğu zamansal, genetik ve gelişimsel çalışmalara veya diğer uygulamalara uygulanabilir. Gelecekte, bu yöntem potansiyel olarak mikroRNA'ların disregulated olduğu gelişimsel bozuklukların tanısında kullanılabilir. Bu protokolün teknik olarak en zorlu kısmı embriyo diseksiyonudur.
Çünkü her embriyo, sahne, görüntü ve daha sonra hızlı bir şekilde hücre canlılığı sağlamak için ayrıştırılmış diseksiyon gerekir. Embriyoları incelemek için, PBS ile hamile bir kadın farenin rahim durulayın ve steril bir plastik 10 santimetre çanak yerleştirin. Tüm decidülümaruz bırakmak için rahim kası soyma ve bölge içeren yaprak ayırmak için mikrodiseksiyon makas kullanın.
Embriyoları incelemek için, PBS ile hamile bir kadın farenin rahim durulayın ve steril bir plastik 10 santimetre çanak yerleştirin. Bölge içeren yaprak ayırmak için mikrodiseksiyon makası kullanın. Temiz PBS ile yeni bir çanak içine tüm embriyolar taşıyın ve tüm çöp bir görüntü almak.
Sonra her embriyoyu ayrı ayrı görüntüleyin ve deneyler arasında büyütme ve pozlama sabittürünce somit lerin sayısını sayın. E8.0'dan daha yaşlı embriyolar için, otik placode hemen üzerinde decapitate ve 48-iyi plaka temiz bir kuyuya kafa aktarın. Kuyuya 250 mikrolitre papain ekleyin ve pipeti yavaşça yukarı ve aşağı.
Kümelenmeleri kontrol etmek için mikroskobu kullanın ve tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar yukarı ve aşağı borulama devam edin. Daha sonra hücrelere 250 mikrolitre FBS ekleyin ve 35 mikrometrelik naylon kafes filtresi ile süspansiyonun 500 mikrolitresini filtreleyin. Filtratyeni bir 1,5 mililitrelik tüp e doğru hareket ettirin ve beş dakika boyunca 200 x g'de aşağı doğru döndürün.
Süpernatant'ı yeni bir tüpe aktarın ve Hücre peletini BSA ile 300 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. Hücreleri yeniden filtre lemeye hazır olduğunuzda filtre kapağı tüpünden filtreleyin ve canlı hücreleri lekelemek için DAPI ekleyin. Her numuneyi 500 mikrolitre RNA ekstraksiyon lysis çözeltisine sıralamak için 70 mikrometre nozüllü bir hücre ayırıcısı kullanın, ardından numuneyi negatif 80 santigrat derecede karıştırıp saklayın.
Her numuneye 5 mikrolitre 6X yükleme boyası ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Örnekleri ilk kuyuda ikinciden başlayarak ve her numune arasında bir şerit bırakarak %6'lık TBE poliakrilamid jeline yükleyin. 0.5X TBE çalışan tampon 30 ila 40 dakika için 150 volt jel çalıştırın.
Jel çalışma bittiğinde, dikkatlice cam plakalar çıkarın ve oryantasyon belirterek, orijinal ambalajından tepsiye yerleştirin. Çalışan tampon çıkarın ve 15 dakika boyunca jel leke. Ve sonra bir UV trans aydınlatıcı üzerinde görüntü.
Bandı 150 baz çiftinde tanımlayın ve çıkarmak için temiz bir jilet kullanın. Adaptör dimer ürününden 130 baz çiftten kaçınmayı unutmayın. Mikrocentrifuge tüpler içine jel dilimleri koyun ve 30 saniye boyunca maksimum hızda aşağı spin.
Daha sonra, jel dilimini mümkün olan en küçük parçalara ezmek ve ucu tüpe çıkarmak için P200 ucu kullanın. Her tüp elüsyon tampon 300 mikrolitre ekleyin, yan jel bit yıkama. Pipet ucunu yeniden takın ve tüpten çıkarmadan önce yıkayın.
1,000 RPM sallayarak 25 santigrat derece bir gecede örnekleri kuluçka. Ertesi gün, 10 dakika boyunca maksimum hızda aşağı spin ve bir RNase-free 96-well plaka supernatant aktarın. Her numune ye 50 mikrolitre temizleme boncukları ekleyin ve karıştırmak için pipet.
Sonra 350 mikrolitre isopropanol ekleyin, numuneyi karıştırın ve sallanırken 10 dakika oda sıcaklığında tabağı kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra plakayı çevirin ve iki dakika boyunca manyetize edin. Supernatant atın ve 30 saniye boyunca% 80 etanol 950 mikrolitre ile boncukyı yıkayın.
Numuneyi üç dakika kurutun, ardından kuyunun altındaki tüm sıvıyı çıkarın. Plakayı manyetik standdan çıkarın. Ve resuspension tamponunun 13 mikrolitresindeki boncukları yeniden askıya alın.
Plakayı iki dakika kuluçkaya yatırın, sonra üç dakika lığına manyetik standa geri aktarın. Süpernatantın 12 mikrolitresini temiz bir tüpe aktarın ve bir gecede dört santigrat derecede veya uzun vadede negatif 20 santigrat derecede saklayın. E7.5, E8.5 ve E9.5'teki embriyolar hasat edildi.
Ve somite altı saatlik zaman aralıklarını çözmek için sahnelendi. Örnekleri benzerliğe göre gruplandırmak için ilke bileşen analizi kullanıldığında, örneklerin yaşa göre kümelendiklerine rastlandı. Premigratory ve migratory nöral krest hücreleri wnt1-Cre ile E8.5 ve Sox10-Cre ile E9.5 olarak etiketlenmiştir.
İki CRE sürücüsünün karşılaştırılması, erken fare embriyolarında farklı popülasyonları işaretlediklerini doğrular. RNA spektrofotometre ve kapiller elektroforez ile ölçüldü. Spektrofotometre izi RNA'nın kontamine protein ve yüksek hücre konsantrasyonu içermediğini ortaya atsa da, yaşla birlikte RNA konsantrasyonundaki değişiklikleri tespit edecek kadar hassas değildi.
Kapiller elektroforez izi, RNA parçalarının konsantrasyonu ve boyutunu tahmin etmek için kullanılabilir. 2, 000 ve 5, 100 nükleotitteki zirveler sırasıyla 18S ve 28S ribozomal RNA'dır. Küçük RNA bölgesi ise yaklaşık 150 nükleotit te bulunur.
Jel çıkarma, küçük RNA sıralama kitaplıklarını bağdaştırıcı astarlarından uzaklaştırmak için kullanılabilir. Eksizyondan önce, her numunede çok sayıda ürün boyutu bulunur. Boyut seçiminden önce ve sonra kapiller elektroforez izleri jel saflaştırma sonrası 150 baz çifti kütüphane ürününün saflığında iyileşme yitirme gösterir.
Bu protokolü, bir RNA hazırlıklarını tek bir örnekten hem küçük RNA sıralama kitaplıklarına hem de toplu mRNA sıralama kitaplıklarına bölmek için tasarladık. Bu, sadece mikroRNA ekspresyonu ile ilgili değil, aynı zamanda hangi mRNA hedeflerinin ifade edilen mikroRNA'lar tarafından düzenlenebileceği sorularını da ele alacaktır. Bu teknik, en yüksek derecede ifade edilen mikroRNA'ların kapsamlı bir görünümünü ve gastrulation ve nöral tüp kapatma arasındaki kranial nöral krest hücrelerindeki hedeflerinin düzenlenmesini sağladı.
