Bu çalışma Sophia Vakfı'nın (SSWO WAR-63) arkadaşları tarafından finanse edildi.

Tüm zebra balığı yetiştiriciliği ve deneyleri, Erasmus MC ve Hayvan refahı mevzuatının kurumsal yönergelerine göre yürütülmüştür. Zebra balığı larvalarının döllenmeden 5 gün sonra kullanılması, Hollanda yönetmeliklerinde belirtildiği gibi, resmi etik onay gerektirmeyen deneyler kategorisine girer.
1. Döllenmeden 5 gün sonra (dpf) yabani tip ve tg(phox2bb:GFP) larvalarının elde edilmesi
<ol><li>Yabani tip zebra balığı yetiştiriciliğini ayarlayın ve 15 cm'lik bir Petri kabında HEPES tamponlu E3 ortamında (bundan böyle E3 olarak anılacaktır) 50 yumurta toplayın. Bu balıkları floresanla aktive edilen hücre sıralaması (FAC'ler) için negatif kontrol olarak kullanın.</li>
	<li>tg(phox2bb:GFP) zebra balığının üremesini ayarlayın ve 15 cm'lik bir Petri kabında E3'te yaklaşık 300 yumurta toplayın.</li>
	<li>Döllenmiş yumurtaları E3'te (maksimum 50 yumurta/tabak) 14 saat/10 saat aydınlık/karanlık döngüsünde, 28,5 °C'de bir inkübatörde saklayın.</li>
	<li>1 dpf'de, döllenmemiş yumurtaları çıkarın ve döllenmiş olanların 5 dpf'ye kadar gelişmesine izin verin.</li>
	<li>1 dpf'de tg(phox2bb:GFP) larvalarını seçin.</li>
</ol>2. Yabani tip bütün larva ayrışması
<ol><li>5 dpf larvasını %0.016 Trikain ile uyuşturun.</li>
	<li>30 zebra balığını 1 mL 10x tripsin-EDTA çözeltisi içeren bir Petri kabında bir tıraş bıçağı kullanarak küçük parçalara ayırın.</li>
	<li>Doğranmış zebra balıklarını toplam hacmi 2 mL 10x tripsin-EDTA çözeltisi olan bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 3 saat buz üzerinde bırakın. Ayrışmayı uyarmak için her saat başı bir P1000 pipeti ile yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
</ol>3. Bağırsak izolasyonu
<ol><li>Diseksiyon mikroskobu altında% 0.016 Trikain ile uyuşturulmuş 6-10 5 dpf larvalarını% 1.8'lik bir agaroz plakasına (25 mL E3 içinde 0.45 g agaroz) yerleştirin</li>
	<li>Zebra balığının kafasına bir böcek iğnesi koyun.</li>
	<li>Bir mendil kullanarak kalan tüm E3'ü çıkarın.</li>
	<li>Diğer organları rahatsız etmeden başka bir böcek iğnesi kullanarak bağırsağı izole edin. Sarının çıkarıldığından emin olun (Ek Şekil S1A).</li>
	<li>İzole edildikten sonra bağırsağı inceleyin ve gerekirse tüm bağırsak dışı materyalleri (örneğin deri, yağ, karaciğer) çıkarın.</li>
	<li>Bağırsağı cımbızla toplayın ve buz üzerinde% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ile fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. NOT: Toplam diseksiyon süresi 3 saatte tutularak en az 244 bağırsak izole edilmelidir. Bu, paralel olarak çalışan iki kişi ile mümkündür.</li>
</ol>4. Bağırsak ayrışması
<ol><li>Tüm bağırsakların diseksiyonundan hemen sonra, mikrosantrifüj tüpünü 30 saniye boyunca tam hızda (13.800 × g) santrifüjleyin.</li>
	<li>PBS/%10 FCS'yi çıkarın, ancak bağırsakların kurumasını önlemek için az miktarda (~100 μL) bırakın. Hücreleri ayrıştırmak için CaCl2 ve MgCl2 içeren HBSS'ye 500 μL 2.17 mg / mL papain ekleyin.</li>
	<li>Papain'i 2.5 μL sistein (1 M) ile aktive edin.</li>
	<li>Bağırsakları 37 °C'de bir su banyosunda 10 dakika inkübe edin. Enzimatik doku sindirimini uyarmak için yarıya kadar (5 dakika sonra) yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
	<li>0,5 mL PBS /% 10 FCS ile önceden ıslatılmış 35 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak hücreleri bir FACS tüpüne aktarın.</li>
	<li>0,5 mL'lik adımlarla toplam 2 mL PBS/%10 FCS ekleyerek süzgeci yıkayın.</li>
	<li>700 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın ve peleti 300 μL PBS/%10 FCS'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Ölü hücreleri (1: 1.000) etiketlemek için 1 μg / mL 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyin ve FACS sırasında dışlanmalarına izin vermek için 5 dakika inkübe edin.</li>
</ol>5. FACS zenginleştirme
<ol><li>Akış sitometresine 3.000 hücre kaydederek sıralanmış hücre popülasyonunun kapılarını ayarlamak için vahşi tip örneğini kullanın (Ek Şekil S1B-E).</li>
	<li>100 μm'lik bir nozul kullanın, saflığa ayırma hassasiyetini ayarlayın ve 200 μL PBS/%5 FCS içeren toplama tüpünü FACS makinesine koyun.</li>
	<li>Bağırsakların hücre süspansiyonunu yükleyin ve çiftleri (Şekil 2B) ve ölü hücreleri (Şekil 2C) hariç tutarak canlı (DAPI-negatif), tek hücreleri toplama tüpüne (Şekil 2C) sıralayın. NOT: tg(phox2bb) zebra balığı için, tüm tek canlı hücreler sıralandığından, GFP+ hücrelerinin oranı yalnızca referans olarak kontrol edilir.</li>
	<li>Hücre tasnifinden sonra toplama tüpünü buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Tripan mavisi ile canlılık kontrolü de dahil olmak üzere hücre süspansiyonunu bir hemositometre ile sayın. Uygulanabilirlik en az% 80 ise, bir sonraki adıma geçin.</li>
	<li>Hücreler artık scRNAseq (yani 10x Genomics Chromium platformu) için işlenmeye hazırdır. Örnek başına yaklaşık 20.000 hücre kullanın.</li>
</ol>

Tek Hücreli RNA Dizilimi için Zebra Balığı Larvalarından Bağırsak Hücrelerinin İşlenmesi

<ol>
	<li>Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+intestinal+function+relies+on+coordinated+enteric+nervous+system,+immune+system,+and+epithelium+eesponses.">Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses.</a> Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).</li><li>Sitrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Gastrointestinal System. , (2014).</li><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organisation+of+the+autonomic+nervous+system:+peripheral+connections.">The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).</li><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology.">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).</li><li>Obata, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+microbiota+and+the+immune+system+on+the+development+and+organization+of+the+enteric+nervous+system.">The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system.</a> Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).</li><li>Heuckeroth, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirschsprung+disease+-+integrating+basic+science+and+clinical+medicine+to+improve+outcomes.">Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).</li><li>Antonucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+intestinal+pseudo-obstruction.">Chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).</li><li>De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+our+understanding+of+the+pathology+of+chronic+intestinal+pseudo-obstruction.">Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).</li><li>Bianco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neuromyopathies:+highlights+on+genetic+mechanisms+underlying+chronic+intestinal+pseudo-obstruction.">Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish.">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).</li><li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish.">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).</li><li>Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+the+development+of+the+enteric+nervous+system+using+a+Tg(-8.3bphox2b:Kaede)+transgenic+zebrafish.">In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish.</a> Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).</li><li>Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+model+organism+for+studying+enteric+nervous+system+development+and+disease.">Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data.">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Kuil, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+characterization+of+the+larval+zebrafish+enteric+nervous+system+at+a+single+cell+transcriptomic+level.">Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level.</a> iScience. 26 (7), 107070 (2023).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+differential+transcriptomes+and+cell+types+in+zebrafish+larvae+intestine+and+liver.">Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver.</a> Cells. 11 (20), 3290 (2022).</li><li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdx1b+protects+intestinal+cell+fate+by+repressing+signaling+networks+for+liver+specification.">Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification.</a> Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).</li><li>Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+atlas+of+microbe-responsive+processes+in+the+zebrafish+intestine.">A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine.</a> Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).</li><li>Kline, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , (2016).</li><li>Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+a+single+cell+suspension+from+zebrafish+retinal+tissue+for+flow+cytometric+cell+sorting+of+Muller+glia.">Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia.</a> Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).</li><li>Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+zebrafish+brain-derived+neurospheres.">Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres.</a> Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).</li></ol>

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Burada, FACS kullanarak 5 dpf zebra balığı larvasının bağırsağının izolasyonu ve ayrışması için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemle, farklı bağırsak hücre tipleri, 10x Genomics Chromium platformu kullanılarak scRNA-seq ile başarıyla toplandı ve analiz edildi. Canlı ENS hücrelerinin de izole edileceğine dair bir gösterge istediğimiz için tg(phox2bb:GFP) zebra balığı hattını seçtik (Şekil 2D). Bununla birlikte, bu yöntemin diğer zebra balığı ilg...

Gastrointestinal (GI) sistem, genel sağlık ve esenlikte hayati bir rol oynayan karmaşık bir sistemdir. Besinlerin sindirimi ve emiliminin yanı sıra atık ürünlerin ortadan kaldırılmasından sorumludur 1,2. GI yolu, uygun bağırsak fonksiyonunu düzenlemek ve sürdürmek için birbirine yakın iletişim kuran epitel hücreleri, düz kas hücreleri, bağışıklık hücreleri ve enterik sinir sistemi (ENS) dahil olmak üzere çoklu hücre tiplerinden oluşur 3,4,5. GI yolunun gelişimindeki kusurlar, besin emilimi, mikrobiyota bileşimi, bağırsak-beyin ekseni ve ENS gibi çeşitli yönler üzerinde geniş kapsamlı etkilere sahip olabilir ve Hirschsprung hastalığı ve Kronik bağırsak psödo-tıkanıklığı gibi çeşitli enterik nöromüsküler bozukluklara yol açabilir 6,7. Bu bozukluklar, Cajal'ın interstisyel hücreleri, düz kas hücreleri ve ENS 6,8,9 gibi çeşitli anahtar hücrelerdeki değişikliklerin neden olduğu şiddetli bağırsak dismotilitesi ile karakterizedir. Bununla birlikte, GI gelişimi ve işlev bozukluğunun altında yatan moleküler mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır.
Zebra balığı, hızlı embriyonik gelişimi, embriyonik ve larva aşamalarındaki şeffaflığı ve genetik izlenebilirliği nedeniyle GI gelişimi ve işlev bozukluğunu incelemek için değerli bir model organizmadır 10,11,12,13,14. Floresan proteinleri eksprese eden çok sayıda transgenik zebra balığı hattı mevcuttur. Böyle bir çizginin bir örneği, enterik nöronlar da dahil olmak üzere tüm phox2bb+ hücreleri15,16 olarak etiketlendiğinden, ENS'yi incelemek için yaygın olarak kullanılan tg(phox2bb:GFP) zebra balığıdır. Burada, tg(phox2bb:GFP) zebra balığı hattını kullanarak, tek hücreli RNA dizileme (scRNA-dizilimi) analizi için döllenmeden 5 gün sonra (dpf) larvalarının bağırsak izolasyonu için bir yöntem sunuyoruz (Şekil 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger v3.0.2</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#D-9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus SZX16</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III sorter machine</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with CaCl2 and MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26000-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222, Tricaine</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>A5040-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat v3</td>
			<td>Stuart et&#160;al. (2019)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Cat#T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gut isolation from zebrafish larvae for single-cell rna sequencing

Gastrointestinal (GI) sistem, yaşam için gerekli olan bir dizi işlevi yerine getirir. Gelişimini etkileyen konjenital kusurlar, enterik nöromüsküler bozukluklara yol açabilir ve GI gelişimi ve disfonksiyonunun altında yatan moleküler mekanizmaları anlamanın önemini vurgular. Bu çalışmada, tek hücreli RNA dizileme (scRNA-dizilimi) analizi için kullanılabilecek canlı, canlı hücreler elde etmek için döllenmeden 5 gün sonra zebra balığı larvalarından bağırsak izolasyonu için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol, zebra balığı bağırsağının manuel diseksiyonuna ve ardından papain ile enzimatik ayrışmaya dayanır. Daha sonra, hücreler floresanla aktive edilen hücre sıralamasına gönderilir ve canlı hücreler scRNA dizilimi için toplanır. Bu yöntemle, epitel, stromal, kan, kas ve bağışıklık hücrelerinin yanı sıra enterik nöronlar ve glia dahil olmak üzere farklı bağırsak hücre tiplerini başarıyla tanımlayabildik. Bu nedenle, zebra balığı kullanarak sağlık ve hastalıkta GI yolunun bileşimini incelemek için değerli bir kaynak olduğunu düşünüyoruz.

The gastrointestinal (GI) tract is a complex system that plays a vital role in overall health and well-being. It is responsible for the digestion and absorption of nutrients, as well as the elimination of waste products1,2. The GI tract is composed of multiple cell types, including epithelial cells, smooth muscle cells, immune cells, and the enteric nervous system (ENS), which communicate closely together to regulate and maintain proper intestinal function3,4,5. Defects in the development of the GI tract can have far-reaching effects on various aspects such as nutrient absorption, microbiota composition, the gut-brain axis, and the ENS, leading to several enteric neuromuscular disorders, such as Hirschsprung disease and Chronic intestinal pseudo-obstruction6,7. These disorders are characterized by severe gut dysmotility caused by alterations in various key cells, such as the interstitial cells of Cajal, smooth muscle cells, and the ENS6,8,9. However, the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction are still poorly understood.
The zebrafish is a valuable model organism for studying GI development and dysfunction due to its rapid embryonic development, transparency during embryonic and larval stages, and genetic tractability10,11,12,13,14. Numerous transgenic zebrafish lines expressing fluorescent proteins are available. An example of such a line is the tg(phox2bb:GFP) zebrafish, commonly used to study the ENS, as all phox2bb+ cells, including enteric neurons, are labeled15,16. Here, using the tg(phox2bb:GFP) zebrafish line, we present a method for intestinal isolation of 5 days post fertilization (dpf) larvae for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis (Figure 1).

Yazar Gündemi: Gastrointestinal Gelişimin Transkriptomik Yönlerini Araştırmak için Zebra Balığı Larvalarının Bağırsak Hücrelerinin İzole Edilmesi ve Analiz Edilmesi 

Tek Hücreli RNA Dizilimi için Zebra Balığı Larvalarından Bağırsak İzolasyonu

Our research aims to investigate the transcriptomic changes occurring during gastrointestinal development and dysfunction in zebrafish larvae. Here, we provide a new protocol that allows isolation of different cell types within the zebrafish intestine, which has potential applications in understanding gastrointestinal health and disease. In recent years, there has been growing interest in exploring the interaction between the enteric nervous system and other intestinal cell types during development and disease.Understanding these complex dynamics using advanced techniques like single-cell RNA sequencing, holds the potential to reveal critical insights into enteric neuromyopathies, leading to more precise diagnostics and treatments. Using this protocol, we successfully identified various intestinal cell types, including epithelial, stromal, bloods, muscle, immune cells, and even enteric neurons and glia, which have not been captured before at this amount using similar approaches. Thus, we provide a reliable technique to study the gastrointestinal composition during development and dysfunction.

Bu protokol ile 5 dpf larvadan tüm bağırsakların başarılı bir şekilde izolasyonunu ve ayrışmasını sağladık. Papain'i ayrışma enzimi olarak kullanarak, hücre canlılığını önemli ölçüde artırdık ve 46,139 izole bağırsaktan tek, canlı hücreleri (tüm hücrelerin% 6.4'ü) içeren 244 olayın yakalanmasını sağladık (Şekil 2A). Yabani tip bütün larvalar, ayıklama işleminin optimize edilmesini sağlamak için bir kontrol olarak kullanıldı, bu da etkili hüc...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Analyzing Intestinal Cells of Zebrafish Larvae for Investigating Transcriptomic Aspects of Gastrointestinal Development at JoVE.com

Burada, tek hücreli RNA dizileme analizi için döllenmeden 5 gün sonra zebra balığı larvalarından bağırsak izolasyonu için bir yöntem açıklıyoruz.

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric ...

Araştırmamız, zebra balığı larvalarında gastrointestinal gelişim ve disfonksiyon sırasında meydana gelen transkriptomik değişiklikleri araştırmayı amaçlamaktadır. Burada, zebra balığı bağırsağında farklı hücre tiplerinin izolasyonuna izin veren, gastrointestinal sağlık ve hastalıkları anlamada potansiyel uygulamaları olan yeni bir protokol sunuyoruz. Son yıllarda, gelişim ve hastalık sırasında enterik sinir sistemi ile diğer bağırsak hücre tipleri arasındaki etkileşimi keşfetmeye artan bir ilgi vardır.Tek hücreli RNA dizilimi gibi gelişmiş teknikler kullanarak bu karmaşık dinamikleri anlamak, enterik nöromiyopatiler hakkında kritik içgörüleri ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir ve bu da daha kesin teşhis ve tedavilere yol açar. Bu protokolü kullanarak, epitel, stromal, kanlar, kas, bağışıklık hücreleri ve hatta enterik nöronlar ve glia dahil olmak üzere çeşitli bağırsak hücre tiplerini başarıyla tanımladık. Bu nedenle, gelişim ve işlev bozukluğu sırasında gastrointestinal bileşimi incelemek için güvenilir bir teknik sunuyoruz.

gut-isolation-from-zebrafish-larvae-for-single-cell-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

989 Görüntüleme.  Erasmus University Medical Center - Sophia Children's Hospital. Araştırmamız, zebra balığı larvalarında gastrointestinal gelişim ve disfonksiyon sırasında meydana gelen transkriptomik değişiklikleri araştırmayı amaçlamaktadır. Burada, zebra balığı bağırsağında farklı hücre tiplerinin izolasyonuna izin veren, gastrointestinal sağlık ve hastalıkları anlamada potansiyel uygulamaları olan yeni bir protokol sunuyoruz. Son yıllarda, gelişim ve hastalık sırasında enterik sinir sistemi ile diğer bağırsak hücre tipleri aras?...

Video: Yazar Gündemi: Gastrointestinal Gelişimin Transkriptomik Yönlerini Araştırmak için Zebra Balığı Larvalarının Bağırsak Hücrelerinin İzole Edilmesi ve Analiz Edilmesi 

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric neuromuscular disorders, highlighting the importance to understand the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction. In this study, we present a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization to obtain live,&#160;viable cells which can be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis. This protocol is based on the manual dissection of the zebrafish intestine, followed by enzymatic dissociation with papain. Subsequently, cells are submitted to fluorescence-activated cell sorting, and viable cells are collected for scRNA-seq. With this method, we were able to successfully identify different intestinal cell types, including epithelial, stromal, blood, muscle, and immune cells, as well as enteric neurons and glia. Therefore, we consider it to be a valuable resource for studying the composition of the GI tract in health and disease, using the zebrafish.

Here, we describe a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization, for single-cell RNA sequencing analysis.

Gelişim Biyolojisi

Obtaining Wildtype and Transgenic Zebrafish Larvae and WildType Whole Larvae Dissociation

Begin by obtaining the wildtype and transgenic zebrafish eggs from the respective breeding setup. Take a 15-centimeter Petri dish containing HEPES-buffered E3 medium or E3.And collect the appropriate amount of fertilized eggs from the desired zebrafish breeding setup. Incubate the fertilized eggs in E3 at 28 degrees Celsius with an appropriate light and dark cycle.At one days post fertilization or dpf, remove any unfertilized eggs and let the fertilized ones develop until five dpf. Select the transgenic zebrafish larvae at one dpf. Before proceeding for whole larvae dissociation, anesthetize the five dpf wildtype larvae using 0.016%Tricaine, and transfer 30 anesthetized larvae into a Petri dish containing one milliliter of 10x trypsin-EDTA solution.Then, using a razor blade, chop the larvae into small pieces in the Petri dish. Transfer the chopped larvae into a micro centrifuge tube with two milliliters of 10x trypsin-EDTA solution, and leave the tube on ice for three hours. Pipette the contents up and down with a P1000 pipette every hour to stimulate dissociation.

Yabani tip ve transgenik zebra balığı larvalarının elde edilmesi ve yabani tip bütün larvaların ayrışması

Isolation and Dissociation of Gut from Zebrafish Larvae for FACS Enrichment of Gut Cells

To begin, prepare a 1.8%agarose plate with HEPES Buffered E3 medium or E3.While working under a dissection microscope, place six to 10 anesthetized larvae in a row on the agarose plate. Put one insect pin on the head of each larvae. Then remove the remaining E3 from the plate using a tissue.Using another insect pin, isolate the intestine from a larvae without disturbing any other organs. Ensure proper removal of yolk. Once isolated, inspect the intestine and remove all non-intestinal material, such as skin, fat, or liver.Use tweezers to collect the intestine and transfer it to PBS containing 10%FCS in a microcentrifuge tube placed on ice. Immediately after the dissection of all intestines, centrifuge the microcentrifuge tube at 13, 800 g for 30 seconds. Remove the supernatant, leaving about 100 microliters in the tube to prevent the intestines from drying out.Add 500 microliters of papain solution to the intestines in the tube. Activate the papain by adding 2.5 microliters of one molar cysteine. Then incubate the tube containing the intestines in a water bath at 37 degrees Celsius for 10 minutes.Pipette the contents up and down halfway after five minutes to stimulate enzymatic tissue digestion. Transfer the dissociated cells into a fluorescence-activated cell sorting, or FACS, tube through a pre-wedded 35-micron cell strainer. Wash the strainer several times by adding 0.5 milliliters of PBS containing 10%FCS to a total wash volume of two milliliters.Centrifuge the collected filtrate at 700 g for five minutes at 4 degrees Celsius, and remove the supernatant. Add one microgram per milliliter DAPI to 300 microliters of PBS containing 10%FCS. Add this mixture to the pellet and resuspend to label the dead cells.Then incubate for five minutes on ice to allow their exclusion during subsequent FACS analysis.

Bağırsak Hücrelerinin FACS Zenginleştirilmesi için Zebra Balığı Larvalarından Bağırsak İzolasyonu ve Ayrışması

FACS Enrichment of Zebrafish Gut Cell Suspension for scRNAseq

To perform fluorescence-activated cell sorting, or FACS, on the gut cells isolated from zebrafish larvae, use the wild-type whole larvae sample to set the gates of the sorted cell population by recording 3, 000 cells on the flow cytometer. Use a 100-micron nozzle and set Sort Precision to 4-Way Purity. Put the collection tube containing 200 microliters of PBS with 5%fetal calf serum in the fax machine.Load the cell suspension prepared from the isolated guts, and after excluding doublets in dead cells, sort live or DAPI-negative single cells into the collection tube. Keep the collection tube on ice after cell sorting, employing a viability check with trypan blue. Count the number of cells in the suspension with a hemocytometer.The cells are now ready to be processed for single-cell RNA sequencing. Use approximately 20, 000 cells per sample.