Yazarlar ayrıca imalat ve cDNA ve shRNA vektörler neogenin için yapıları paylaşımı için Gürcistan Sağlık Bilimleri Üniversitesi&#39;nden Dr. Xiong&#39;un grubu kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Kore Araştırma Vakfı tarafından finanse edilen Temel Bilimler Araştırma Programı (2013R1A1A4A01012572) hibe yoluyla ve Sahmyook Üniversitesi&#39;nden bir araştırma hibe ile desteklenmiştir.

NOT: Hayvan ıslahı ve bakımları için tüm prosedürler Sahmyook Üniversitesi, Seul, G. Kore IACUC düzenlemelerine göre yapılmıştır. 1. Süperovulasyon, Islahı ve Ovidukt İzolasyon <ol><li> aşağıdaki koşullar altında inbred C57BL / 6 fareleri bakımı: 22 ± 3 ° C, ~% 60 nem, 12 st ışık / karanlık çevrimi ve su ve gıda ad libitum verilmiştir. </li><li> 0.1 mL, 5 İÜ gebe kısrak serum gonadotropini (PMSG) intraperitoneal enjeksiyonu ile 3-5 haftalık dişi farelerin superovulasyon Uyarmaktadır / kafa 0.1 mL, 5 İÜ insan koryonik gonadotropinin bir intraperitoneal enjeksiyon (HCG) 48 saat sonra ve ardından /kafa. </li><li> Hemen hCG enjeksiyonu takiben, bir gecede aynı kafeste tutarak aynı gerginlik cinsel olgun erkeklerle superovulation kaynaklı kadın dostum. </li><li> Ertesi sabah, kadın genital sisteminin bir çiftleşme fişi veya vajinal fiş varlığı ile başarılı bir şekilde çiftleşme onaylayın. </li><li> Hamile kadın fareler kurbanCO 2 zehirlenme hCG enjeksiyonundan sonra servikal dislokasyon 18-20 saat izledi. </li><li> Cildi ve daha sonra ince makasla periton tabakayı keserek karın boşluğuna açın. </li><li> ince forseps ile rahim boynuzları Pick up ve vücut boşluğuna yavaşça rahim, yumurtalık, yumurtalık ve yağ yastığı uzak çekin. </li><li> fallop ve ince makas ile yumurtalık arasındaki alanı kesin. Ekli uterusun üst kısmının en az 1 cm bırakarak, forseps konumlandırmak ve yumurtalık yakın rahim kesti. </li><li> Oda sıcaklığında M16 ortamı içeren 35 mm Petri kabı oviductal ampulla aktarın. Aynı çanak çeşitli farelerden fallop borularına havuz. </li><li> embriyoların alımı için bir stereomicroscope altında yemekler yerleştirin. </li></ol> 2. Alma ve 2-pronüklear Kültür (2-PN) Embriyolar <ol><li> , 30 veya 32 G derialtı iğne ucunu kesin bir künt ucu içine eziyet ve bir reçeteye iğne olarak kullanabilirsiniz. </li><li> kullanımince forseps kızarma iğne üzerine yumurta kanalının sonuna doğru kaydırın. Yavaşça bir yerde tutmak için çanak alt karşı kızarma iğne ucu basın. M16 ortamının 0.1 mi, bir Petri kabı içine 2-PN embriyolar serbest bırakmak için ~ sahip yumurta kanalının yıkayın. </li><li> steril bir cam pipet kullanarak yeni bir Petri kabı içine aktarabilirsiniz stereomicroscope altında kızardı M16 ortamdan kümülüs kitleleri çevreleyen birlikte 2-PN embriyoların kurtarın. </li><li> 5-10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de Dulbecco&#39;nun fosfat tamponlu tuz (DPBS) içinde% 0.1-0.5 hyaluronidaz 1.0 ml enzimatik sindirme ile 2-PN embriyolardan kümülüs hücreleri ayırmak. </li><li> yumuşak bir cam pipet ve kümülüs hücrelerin fiziksel ayrılması ile pipetleme embriyolar denude. </li><li> embriyo başına taze fosfat tamponlu salin (PBS) 30-50 ml arındırılır embriyolar üç kez yıkayın. </li><li> 10 mg / ml sığır serumu albümini (BSA, Fract ile takviye M16 ortamı bir 35 mm plastik Petri kabındaki embriyolar inkübeen az 4 saat, daha sonra genellikle mikroenjeksiyon gerçekleşinceye kadar bir nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de iyon V). </li></ol> 3. Embriyo revers transkripsiyon (RT) ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) <ol><li> blastosist aşamasına kadar her aşamada en az 10 embriyo toplamak ve ters transkriptaz, RNaz inhibitörü, oligo dT primeri, rastgele 6mers dNTP karışımını içeren transkriptaz ön kanşım çözelti, ters 5x 4.0 ul bunları havuz ve reaksiyon tamponu PCR tüp. </li><li> W 95 ° C&#39;de 5 dakika inkübasyon ile takip 1 saat boyunca 42 ° C &#39;de hemen RT reaksiyon başlatılır 200 ° 30 saniye boyunca bir araya getirilmiş embriyolar 20 ul bir toplam hacme RNaz içermeyen damıtılmış H2O ilave edin ve sonikasyon. </li><li> Üretilen cDNA çözeltisi, her 5.0 uL, neogenin için primerler normal PCR yürütmek, CDX2, Sox2 Tead4, Nanog, Oct3 / 4 veya β-aktin (primer dizileri Tablo l&#39;de verilen </strong&gt; 1. PCR, 95 ° C&#39;de 15 saniye inkübasyondan 40 döngü oluşur (Tablo 1 &#39;de gösterilmektedir) tavlama sıcaklığında 30 saniye ve 72 ° C&#39;de 30 san. </li><li> % 2 agaroz jeli üzerinde elektroforez ile, ayrı PCR ürünleri ve etidyum bromid ile boyanarak UV ışığı altında jel görselleştirmek. </li><li> β-aktin seviyelerine karşı hedef gen ifadesini normalleştirmek. </li></ol> Embriyolar 4. İmmünositokimya <ol><li> PBS,% 0.01 BSA ihtiva eden bir kısa yıkama ile 3 kez ve ardından oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit ile her aşamada embriyolar düzeltildi. </li><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında% 0.1 Tween 20 ve% 0.1 Triton X-100 içeren PBS 1.0 ml 10 embriyo inkübe edilerek Permeabilize Hücre zarları. </li><li> PBS 1.0 ml geçirgen embriyolar inkübe spesifik olmayan engellemek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca,% 10 normal keçi serumu ile takviye edilmiştir. </li><li> Engellenen embriyolar zekâ inkübe1 H tavşan anti-neogenin antikorları: PBS içinde 100 seyrelti, gece boyunca 4 ° C&#39;de% 0.1 BSA içeren. </li><li> PBS damla 30 sn her biri için üç yıkamadan sonra, 1 Alexa 488-konjuge keçi anti-tavşan IgG veya Alexa 568-konjuge keçi anti-tavşan IgG ile ya embriyolar inkübe: PBS / BSA çözeltisi 500 seyreltme, gece boyunca 4 ° C&#39;de . </li><li> aktin filamanlarını görselleştirmek için, oda sıcaklığında, 1 saat süre ile, PBS içinde 1 ug / ml Phalloidin embriyolar inkübe edin. </li><li> PBS, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1 ug / ml DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol, dihidroklorür) ihtiva eden 5 ml ekleyerek çekirdekleri leke. </li><li> Yıkama PBS ile üç kez kısaca embriyolar. </li><li> Bir bardak slayt embriyo transferine ve madeni yağ bir damla ile bunları kapatın. </li><li> Uygun dalga boyunda bir uyarma ile konfokal mikroskop ile 1,000X büyütmede görüntü al. </li></ol> Neogenin-RFP ve Neogenin-siRNA GFP Plazmidler 5. Hazırlık <ol><li> AltcDNA Kırmızı Floresan Protein (RFP), vektör ihtiva-eden neogenin-bayrak-RFP sonuçlanan içine fare neogenin kodlama klonlamak. </li><li> Emerald yeşil flüoresan protein (EmGFP), vektör ihtiva-eden pcDNA-EmGFP-miR-neogenin sonuçlanan içine neogenin hedef alan küçük bir saç tokası RNA alt-klonlanmıştır (Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi). </li><li> neogenin-bayrak RFP ve pcDNA-EmGFP-miR-neogenin plazmidler hem yükseltmek ve geleneksel yöntemlerle onları arındırmak. </li><li> Plazmidlerin nihai konsantrasyonlar ayarlama için, steril Tris-EDTA (TE) tampon / ml 1.0 ug. </li></ol> 2-PN Embriyolar içine Plazmidler 6. Mikroenjeksiyon <ol><li> Taze M16 medya ile, kısaca bir kez soyulmuş 2-PN embriyoların yıkayın. </li><li> çekirdeklerine gözlem için izin vermek için bir masa üstü santrifüjü içinde 1,000 x g&#39;de 10 dakika süre ile 2-PN embriyolar santrifüjleyin. </li><li> Bir Additi% 5 CO2 37 ° C&#39;de mineral yağ altında embriyo başına M16 ortamı 20-30 ul&#39;lik bir mikro damla embriyolar inkübeÖnal 1-2 saat. </li><li> borosilikat cam kapiller tüp çekerek enjeksiyon pipetler ve holding pipetler imalatı (OD = 1.2 mm; J = 0.94 mm) mekanik bir çekici ile. </li><li> Bir microgrinder ve microforger kullanarak künt ipuçları ve &lt;500 mikron ucu uzunluğu ve 1-2 mikron ucu iç çapı cilalı açıklıklar enjeksiyon pipetler Üretiyor. </li><li> 20 um&#39;lik bir iç çapa ve 100 um arasında bir dış çapa sahip kör ipuçları ve perdahlı açıklıklara sahip olacak şekilde pipetler tutarak imal. </li><li> 1.0 ug / ul plazmid solüsyonu yeterli bir miktarı ile yüklenebilir enjeksiyon pipetler (&gt; 200 nl). </li><li> Microinject ~ motorlu bir mikromanipülatör bağlı bir mikropüskürtücü kullanılarak ön çekirdek birine, her 2-PN embriyo için plazmid solüsyonu 10 uL; Bu işlem sırasında, bir tutma pipeti ile negatif bir basınç uygulayarak pozisyonda embriyolar tutun. </li><li> Mikroenjeksiyon sonra, l taze M16 medya ile 2-PN embriyolar 3 kere yıkayın1 dakika her zaman daha ess. </li><li> Kültür ortamı buharlaşmasını önlemek için bir mineral yağ damlası ile kaplanmış bir plastik kültür tabağına taze M16 ortamının bir damla 2-PN embriyolar. </li><li> Bir diferansiyel girişim kontrast altında 24 saat aralıklarla (DIC) 200X büyütme ters mikroskop embriyolar gözlemleyin. </li></ol>

<ol><li>Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+molecular+regulation+of+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst.</a> Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).</li>
<li>Sasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+trophectoderm+fate+specification+in+preimplantation+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development.</a> Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).</li>
<li>Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tead4+is+required+for+specification+of+trophectoderm+in+pre-implantation+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse.</a> Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).</li>
<li>Ovitt, C. E., Schöler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+Oct-4+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo.</a> Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).</li>
<li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Oocyte+Microinjection%2C+Maturation+and+Ploidy+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment.</a> J. Vis. Exp. (53), e2851(2011).</li>
<li>Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mouse+blastocyst+genes+that+are+down+regulated+by+double-stranded+RNA-mediated+knockdown+of+Oct-4+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression.</a> Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).</li>
<li>Khang, I., Sonn, S., Park, J. -H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+epithin+in+mouse+preimplantation+development%3A+Its+role+in+compaction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction.</a> Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).</li>
<li>Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+DNA-Specific+Stain+Methyl+Green+in+the+Fluorescent+Labeling+of+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos.</a> J. Vis. Exp. (99), e52769(2015).</li>
<li>Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neogenin+as+a+receptor+for+early+cell+fate+determination+in+preimplantation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos.</a> PLoS One. 9 (7), e101989(2014).</li>
<li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek rakip mali çıkarlarını yok yok.

Mevcut protokol, fare embriyogenez sırasında erken hücre farklılaşmasında neogenin rolünü araştırmak için 2-PN fare embriyoları içine genetik materyallerin mikroenjeksiyon yeni yöntemler, cDNA veya shRNA ya göstermektedir. preimplantasyon embriyoların genetik modifikasyon, örneğin altında yatan moleküler mekanizmaları, ilk hücre soyu belirlenmesi hakkında önemli bilgiler ortaya çıkarmada güçlü bir tekniktir. Genetik modifikasyonlar gen fonksiyonu tespit etmek için en sık kullanılan yönte...

Pre-implantasyon embriyonik gelişim morula ve blastosist tek hücreli aşamasından, birçok farklı aşamaları ayrılabilir. Çok kanıt polarite ve pozisyon ipuçları ilkel trofoblast (TE) ve iç hücre kütlesinden (ICM) içine erken hücre kaderi belirlenmesinde rol oynadığını düşündürmektedir. Bununla birlikte, selüler sinyallere dönüştürülebilen nasıl ipuçları, doğası ve fizyolojik içerikleri burada bu sinyaller bilinmemektedir hücre soyu farklılaşmasını başlatma yeteneğine sahiptirler. Bu farklılaşmış hücreler daha sonra plasenta 1-3 embriyo oluşumu ve büyümesi için gerekli olan karakteristik yapıları ve fonksiyonları üzerine almaya başlayan, uzmanlaşma uğrarlar. Pre-implantasyon embriyoları siRNA veya hedef cDNA gibi modifike edilmiş genetik malzemenin doğrudan doğruya enjekte edilerek manipülasyon için özellikle uygundurlar ve bu nedenle belirli bir hedef molekülleri okumak için kullanılabilir. Genetik dair artan bir anlayış vardıromurgalı embriyolarının analizi embriyonik gelişim 4 anlayışımızı ilerleyen için kritik öneme sahiptir. zamanında bağlamında bir embriyo, bir vahşi tip gen veya mutant formunda hassas bir giriş gain- veya zarar fonksiyon-geninin büyük gelişimsel olarak düzenlenen genlerin çalışma kolaylaştırmıştır gerçekleştirmek için. Kaybı: ve kazanç fonksiyon-bağımsız erken memeli olmayan ve memeli embriyolara genetik materyallerin mikro-enjeksiyon için büyük boyutları ve büyük reseptivite 5 oldukça basittir. Mikroenjeksiyon tipik olarak viral vektörler kullanılarak gerçekleştirilir. Özellikli bir avantaj olarak, viral vektörler ve transgenlerin fazla viral olmayan vektörler kullanılarak kolaylığı alınmıştır. Fare embriyoları bir hızlı kaybı: ya kazanç fonksiyon-sentezleme sistemi bize incelemek ve omurgalı embriyoloji 6,7 gen fonksiyonlarını anlamak için izin veren geliştirilmiştir. embriyoların floresan etiketleme büyük ölçüde MICR seçimini kolaylaştıracakoinjected veya genetik embriyolar manipüle ve aynı zamanda dolaylı olarak floresan yoğunluğu 8 göre mikro-enjekte siRNA veya cDNA ekspresyon seviyesini belirlemek için bir yöntem verin. Bu etiketleme, floresan protein cDNA, GFP veya RFP gerçekleştirmek için, birlikte enjekte füzyon konstruktları ya da ayrı ayrı ya da gibidir. GFP veya RFP floresans yoğunluğu bu kaybı: temin ya kazanç fonksiyon-başarılmıştır için siRNA veya yabancı DNA&#39;nın sentezlenmesi kapsamını ortaya koymaktadır. Burada, bize preimplantasyon fare embriyoları erken hücre farklılaşmasında önemli hücre dışı ipuçlarını ileten bir reseptör olarak neogenin tanımlamak için izin kaybı: ve kazanç-of fonksiyon tekniği için bir mikromanipülasyon protokol mevcut.

<table><tbody><tr><td>M16 medium,</td><td>Gibco BRL (Grand Island, NY)</td><td>M7292 LOT# 11A832</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum,&amp;nbsp;</td><td>Dako (Glostrup, Denmark)</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Folligon, Intervet, Holland</td><td>G4877-1000IU LOT#SLBD0719V</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CG5-1VL LOT# SLBC6783V</td><td></td></tr><tr><td>human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin&amp;nbsp;</td><td>(Intervet, Holland)</td><td>(invitrogen , 15596-026)</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&amp;reg; III Reverse Transcriptase</td><td>lifetechnologies</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>PCR pre mixture</td><td>&amp;nbsp;(Bioneer, Daejon, S. Korea)</td><td>GenDEPOT , A0224-050</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (molecular grade)</td><td>BioRad</td><td>161-3101</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td><td>Affymetrix USA</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>polyclonal rabbit anti-neogenin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology, US</td><td>SC-15337</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody</td><td>Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td><td>A-11094</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody</td><td>Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; 555 Phalloidin</td><td>Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen, USA</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>3720-RG</td><td></td></tr><tr><td>all plasmid constructs&amp;nbsp;</td><td>Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA).</td><td></td><td>for the present studies were kindly provided by&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Neon&amp;reg;&amp;nbsp; Transfection System</td><td>lifetech</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscrope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Micromainpulation system with Nikon</td><td>Nikon</td><td>Narishige ONM-1</td><td></td></tr><tr><td>Micro Injector</td><td>Nikon Narishige</td><td>GASTIGHT #1750</td><td></td></tr><tr><td>Holder</td><td>Nikon Narishige</td><td>Narishige IM 16</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Nikon Narishige</td><td>Narishige MF-900</td><td></td></tr><tr><td>grinder</td><td>Narishige</td><td>EG400</td><td></td></tr><tr><td>Puller</td><td>Sutter Instrumnet company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Thermo Scientific Forma</td><td>EW-39320-16</td><td></td></tr><tr><td>Veriti&amp;reg; 384-Well Thermal Cycler&amp;nbsp;</td><td>lifetechnologies</td><td>4388444</td><td></td></tr></tbody></table>

loss- and gain-of-function approach to investigate early cell fate determinants in preimplantation mouse embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

Biz o neogenin geçici olarak erken 2-hücreli aşamada olduğu gibi ve kalıcı erken morula kadar görünen ama geç morula ve blastosist aşamaları (Şekil 2A) de eksik olma, preimplantasyon fare embriyoları erken gelişim aşamalarında ifade edilir keşfetti. Buna ek olarak, neogenin uzamsal dağılımı esas olarak dış hücrelerine sınırlandırılmıştır. RT-PCR analizi sonuçlarını 4-hücre aşamasında zirve ama tamamen sonra (Şekil 2b)</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos at JoVE.com

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Bu protokolün amacı, bir kaybı: tanımlamak ve kazanç-of trofoektoderm ve preimplantasyon fare embriyoları iç hücre kütlesi farklılaşma yol açan bir sahne özgü reseptör olarak neogenin tanımlamak için de geçerlidir fonksiyonu yöntemi etmektir.

Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

loss-gain-function-approach-to-investigate-early-cell-fate

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.8K Görüntüleme.  Dankook University.  Bu protokolün amacı, bir kaybı: tanımlamak ve kazanç-of trofoektoderm ve preimplantasyon fare embriyoları iç hücre kütlesi farklılaşma yol açan bir sahne özgü reseptör olarak neogenin tanımlamak için de geçerlidir fonksiyonu yöntemi etmektir. 

Video: Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, cell culture has been widely used in developmental biology studies. However, it is important to determine whether in vitro cultured cells truly represent in vivo cell types. Grafting cells into embryos, followed by an assessment of their contribution during development is a useful method to determine the potential of in vitro cultured cells. In this study, we describe a method for grafting cells into a defined site of early postimplantation mouse embryos, followed by ex vivo culture. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing precise localization and adjustment of the number of cells receiving exogenous DNA with both high transfection efficiency and low cell death. These techniques, which do not require any specialized equipment, render experimental manipulations of the gastrulation and early organogenesis-stage mouse embryo possible, allowing analysis of commitment in cultured cell subpopulations and the effect of genetic manipulations in situ on cell differentiation.

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

Erken Postimplantation Fare Embriyolar içine Hücreleri veya DNA Kesinlikle lokalize Transferi Yöntemleri

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Gelişim Biyolojisi

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genetik

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

Morfogenez ve embriyonik ve Perinatal aort patogenezi okumaya vivo içinde ve doku ve hücre Explant yaklaşımları kullanma

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients and waste between the mother and fetus and the production and delivery of growth factors and hormones. Placental genetic manipulations in mice are critical for understanding the placenta's specific role in prenatal development. Placental-specific Cre-expressing transgenic mice have varying effectiveness, and other methods for placental gene manipulation can be useful alternatives. This paper describes a technique to directly alter placental gene expression using CRISPR gene manipulation, which can be used to modify the expression of targeted genes. Using a relatively advanced surgical approach, pregnant dams undergo a laparotomy on embryonic day 12.5 (E12.5), and a CRISPR plasmid is delivered by a glass micropipette into the individual placentas. The plasmid is immediately electroporated after each injection. After dam recovery, the placentas and embryos can continue development until assessment at a later time point. The evaluation of the placenta and offspring after the use of this technique can determine the role of time-specific placental function in development. This type of manipulation will allow for a better understanding of how placental genetics and function impact fetal growth and development in multiple disease contexts.

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

Here we describe a time-specific method to effectively manipulate critical developmental pathways in the mouse placenta in vivo. This is performed through the injection and electroporation of CRISPR plasmids into the placentas of pregnant dams on embryonic day 12.5.

Fare In Vivo Plasental Hedefli CRISPR Manipülasyonu

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

Erken Fare Embriyolarından Sıralama için Küçük RNA Kütüphanelerinin Hazırlanması

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an oocyte by a spermatozoon creates a totipotent zygote. Recently, several publications have reported that haploid embryonic stem cells (haESCs) can be a substitute for gametic genomes and contribute to embryos, which develop into mice. Here, we present a protocol to apply parthenogenetic haESCs as a substitute of sperm to construct embryos by intracytoplasmic injection into oocytes. This protocol consists of steps for preparing haESCs as sperm replacement, for injection of haESC chromosomes into oocytes, and for culture of semi-cloned embryos. The embryos can yield fertile semi-cloned mice after embryo transfer. Using haESCs as sperm replacement facilitates genome editing in the germline, studies of embryonic development, and investigation of genomic imprinting.

This article aims to demonstrate the use of parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute for sperm for the construction of semi-cloned embryos.

Sperm Yerine Fare Partenogenetik Haploid Embriyonik Kök Hücrelerin Uygulanması

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

Tek Hücreli Dizileme için Gastrolama Fare Embriyosunun İzolasyonu ve Genotiplemesi

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

Yazar Spotlight: Tek Hücre Çözünürlüğünde Soya Özgü Mutant Embriyoları Analiz Etmek İçin Bir Boru Hattı

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Erken Postimplantation Fare Embriyolar içine Hücreleri veya DNA Kesinlikle lokalize Transferi Yöntemleri

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Morfogenez ve embriyonik ve Perinatal aort patogenezi okumaya vivo içinde ve doku ve hücre Explant yaklaşımları kullanma

Fare In Vivo Plasental Hedefli CRISPR Manipülasyonu

Erken Fare Embriyolarından Sıralama için Küçük RNA Kütüphanelerinin Hazırlanması

Sperm Yerine Fare Partenogenetik Haploid Embriyonik Kök Hücrelerin Uygulanması

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar