Nöral Kök Hücrelerin Sıçan ve Fare Beynine İntra-Arteriyel Teslimatı: Serebral İskemiye Uygulama

İnme, dünya çapında mortalite ve sakatlıkların önde gelen nedenidir. Trombolisis ve serebral vasküler oklüzyonun cerrahi olarak çıkarılması belirli hastalarda yapılabilse de inmeye karşı etkili tedavilere acil ihtiyaç vardır. Burada, kök hücrelerin inme tedavisi için potansiyel bir rejim olarak iskemik hemisfere kateter bazlı, intra-arteriyel bir iletim gösterdiğiniz de bu.

İlk olarak enjeksiyon kateterinin ve cerrahi kancaların nasıl hazırlanacağını tanıtıyoruz. İntra-arteriyel enjeksiyon için iki tip enjeksiyon kateter tasarladık. Tasarım bir tüp yıkama gerektirmeyen bir çözelti veya süspansiyon enjeksiyonu için kullanılır.

Tasarım iki nöral kök hücrelerin enjeksiyonu sağlar, ölü hacmin bir floş tam hacim sunmak için takip. Enjeksiyon kateterleri bir dizi inşa etmek için, 26 gauge ve 20 gauge iğneler, MRE 25 kateter 10 ila 15 santimetre uzunluğunda ve MRE 50 ve MRE 10 kateter üç santimetre uzunluğunda gerekir. Hem iğne uçlarını kesin ve tüpü yeniden açmak ve kenarları pürüzsüz ve sonra delik temizlemek ve enkaz yıkamak için distile su ile floş zımpara üzerinde metal ucunu parlatmak.

Şekil, parlattıktan sonra pürüzsüz bir delik ile yeniden açılan iğne ucunu kestikten sonra 20 kalibrelik bir iğnenin kapalı ucunu gösterir. Mikroskop altında, 20 gauge iğneyi MRE 50 borunun ucuna takın. 26 gauge iğneyi bükün ve ardından 20 gauge iğne ucunun altındaki boruya nüfuz edin.

26 gauge iğneyi süper tutkalla sabitleyin. Sonra gücü artırmak için sağlam bir blok oluşturmak için iki iğne göbek ve tüp ve epoksi gömmek. Ayrıca cerrahi sitelerin daha iyi maruz kalma için pozisyonda doku tutmak için üç cerrahi kanca gerekir.

27 kalibrelik bir iğneden bir buçuk ila iki santimetre uzunluğundaiğne mili kesin ve her iki ucunu da mat olana kadar zımpara kağıdında parlatalayın. Şaftı bir ucundaki kancaya, diğer ucunda halka şeklinde bükmek için küçük bir hemostatik kelepçe kullanın. Halka nın içine 10 ila 15 santimetre uzunluğunda bir MRE 25 kateteri takın ve net bir cerrahi bantla sabitleyin.

Aynı yöntemi kullanarak iki kanca daha yapın. Kanca ve kateter sistemi sterilizasyon için %70 etanolle ıslatılmalıdır. Hayvan denekleri ile ilgili tüm prosedürler Kentucky Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

KKT embriyonik fare beynini gfp kültürü için kullanıyoruz, pozitif nöral kök hücreler. GFP pozitif embriyolar floresan mikroskop üzerinde FITC kanalında kolayca görüntülenebilir. Yabani tip embriyolar aynı pozlamayı kullanarak floresan göstermezler.

Yabani tip embriyoların otofloresansı sadece maruz kalma süresi 100 kat artırıldığında görülebilir. Embriyonik korteks toplanır ve üreticinin protokolü ne göre nöral kök hücre kültürleri kurmak için kullanılır. Bu nöral kök hücreler nörosferler oluşturabilir ve 10 nesil boyunca geçiş olabilir ve glia içine ayırt edebilirsiniz nöronlar vardır.

Nanog, SSEA1, Oct4 ve Sox3 gibi embriyonik kök hücre belirteçlerinin paneli nörosferlerde ise kök hücre özelliklerini tanımlamak için kullanılabilir. Nörosferler, üreticinin protokolüne göre medyada kültüre alındı ve nöral kök hücre iletimi için üçüncü ve beşinci pasajlar arasında kullanılıyordu. Hem fareler hem de sıçanlar için sol hemiskemik inme, filament bazlı, orta serebral arter oklüzyonu, MCAO ve türe bağlı olarak bazı değişiklikler yapıldı.

Farelerde, filaman ortak karotis arter yoluyla yerleştirilir, CCA ve internal karotis arter içine gelişmiş, ICA. Sıçanlarda iken, filament dış karotis arter yoluyla tanıtıldı, ECA ICA içine çünkü büyük çalışma alanı. Burada fare ameliyatını gösteriyoruz.

Boyun boyunca bir orta hat kesi yaptıktan sonra, künt diseksiyon kullanarak altta yatan dokuları ayırın. Daha iyi bir görme alanı elde etmek için 27-gauge iğne şaftlarından yapılmış üç mikrocerrahi kanca kullanın. Siyah kare bir sonraki adım için cerrahi alanı gösterir.

Sol CCA üzerinde kas tabakası dikkatle sol CCA ve vagus siniri ortaya çıkarmak için açıktır. Bifurcation ulaşana kadar CCA izleyin. Dikkat germek için değil, yerinden veya bu CCA veya vagus sinir sıkmak için uygulanmalıdır.

CCA ve vagus sinirini kaplayan berrak bağ dokusunu dikkatlice açın. Bu CCA'nın altındaki boşluğu bir ucuyla birlikte boşaltın ve CCA sapını mümkün olduğunca izole edin. CCA altında bir çift iplikli altı O örgülü naylon cerrahi dikiş.

CCA'nın altında yatan dikişlere bırakmak için orta noktayı kesin. CCA'nın altına başka bir naylon dikiş yerleştirin. Üst dikiş üzerine bir slipknot bağlayın, gevşek tutmak.

İki alt sütür ayırın. Orta dikişle bir düğüm at, şimdilik gevşek tut. Bir cerrahın düğümini daha düşük bir dikişle bağlayın ve mümkün olduğunca proksimal uca taşıyın.

Dikiş uçlarını kırpın. Ayrıca çatallanma ötesinde CCA ortaya çıkarmak. Çatallanma için üst gevşek slipknot itin ve kan geri akışını önlemek için sıkın.

CCA yanında silikon kauçuk kaplamalı 70 naylon MCAO dikiş lay. Mikro makas kullanarak, CCA üzerinde küçük bir kesi kesti, alt düğüm yanında. MCAO sütürucunu bu kesi den CCA'ya yerleştirin ve üst düğüme doğru ilerletin.

Orta düğümün pozisyonunu ayarlayın ve MCAO dikişini pozisyonda tutana kadar sıkın. Düğümü aşırı sıkmayın. Üst düğümü bırakın, ancak aynı yerde başka bir gevşek kayma düğüm olun.

MCAO dikişini ICA'ya ilerletin. MCAO dikişin bifurkasyonu ICA'ya geçirin. Dikiş yolu nispeten düz olmalı, ilerledikçe doku içine daha derin girerek.

Dikiş ucundaki gümüş işareti kontrol edin. Çatallanmaya ulaştığından emin ol. MCAO dikişin yönünü tekrar kontrol edin.

Kan sızıntısı olmaması için üst ve orta düğümleri ayarlayın. MCAO dikişini daha da ilerletin, MCAO dikişini yerinde sabitlemek için iki üst düğümü sıkın. Bir saatlik iskemi için kayıt süresini başlatın.

Bir saatlik iskemiden sonra hayvanı anesteziye alıyoruz ve deri yarasını tekrar açıyoruz. Cerrahi bölgeyi ortaya çıkar. Üst ve orta slipknot'ları bulun.

Yavaşça üst düğümü bırakın. Beyaz silikon kauçuk parçası orta düğümulaşana kadar yavaşça MCAO sütür çekin. Kanamayı önlemek için MCAO sütürlerini yerinde tutmak için üst düğümü sıkın.

Yavaşça orta slipknot bırakın. Sonu üst düğümü geçene kadar MCAO dikişçekin. Üst düğümü sıkın.

Orta kaymayı CCA'daki kesinin hemen üzerine yerleştirin. Orta slipknot sıkın. Üst düğümü çıkarın.

Orta düğümün kesme sütür uçları. Deri yarasını kapatın ve hayvanın iyileşmesini bekleyin. Deneyimlerimize göre, sinirsel kök hücreler inmeden bir ila üç gün sonra bu arteriyel yoldan güvenli bir şekilde enjekte edilmiş.

Yine, nöral kök hücre enjeksiyonu için fare ve sıçan ameliyatları arasında küçük farklılıklar vardır. Ve burada fare ameliyatını gösteriyoruz. İnme sonrası üçüncü günde, hayvanı anestezi ye, yarayı tekrar aç ve CCA'yı tekrar ortaya çıkar.

CCA altında bir çift iplikli cerrahi dikiş koymak ve iki dikiş almak için orta noktada kesti. İki sütürü düzgün bir şekilde yerleştirin. Üst dikiş ile bir slipknot olun.

Çatallanmanın tam altına yerleştirin. Üst slipknot sıkın. Orta dikiş ile başka bir slipknot olun.

İnme ameliyatından kalan kesilmiş düğümün hemen üzerinde küçük bir kesi kesin. MRE 10 kateterinucunu yaklaşık 45 derecelik bir açıyla kırpın. CCA'daki kesiği girmek için bu keskin ucu kullanın.

Giriş açısını ve kateteri yerleştirmek için kullanılan kuvveti düzgün bir şekilde ayarlamaya dikkat edin. Aksi takdirde kateter CCA'ya giremeyebilir veya delmeyebilir. Kateteri takın ve uç üst düğüme ulaşana kadar ilerleyin.

Kateteri yerinde tutmak ve kan bağı olmamasını sağlamak için orta slipknot'u sıkın. Üst düğümü serbest bırak. Üst dikiş ile bir kayma düğüm olun.

Kateterin CCA içindeki açısını ve her iki düğümün pozisyonlarını hızlı bir kan akışı görünene kadar ayarlayın, bu da kateter ve CCA akışı arasında başarılı bir iletişim olduğunu gösterir. Şırınga pompasını çalıştırın. Kateterdeki kan CCA'ya geri atılacak.

Beş dakika sonra enjeksiyonu sonlandırın. Üst düğümü at. Orta düğümü bırakın ve kateteri geri çekin.

Orta düğümü at. Tüm düğümleri kırpın. Yarayı kapatın ve hayvanın iyileşmesine izin verin.

İntra-arteriyel enjeksiyondan sonra, GFP etiketli nöral kök hücreler çoğunlukla ipsilateral hemisferde bulunur. Burada, enjeksiyondan bir gün sonra hipokampal dentat girustaki dağılımı gösteriyoruz. Ipsilateral hemisferde, korteks ve striatum lokalize GFP pozitif nöral kök hücrelerin bazıları, ekspres çift kortizon, olgunlaşmamış nöronların bir belirteç.

Bunlar, enjeksiyondan yedi gün sonra nöral kök hücre enjeksiyonu olan veya olmayan sahte ve inme hayvanlarından alınan temsili görüntülerdir. Doğumdan 30 gün sonra, araç enjeksiyonu alan hayvanlarda FITC kanalı ile sadece küçük oto floresan tespit edilebilir. Kök hücrelere enjekte hayvanlarda iken, GFP etiketli nöral kök hücreler gleo marker GFP veya nöronal marker tujuan gibi çeşitli hücre belirteçleri ifade ile yaralı beyinbulunabilir.

Her görüntüdeki beyaz oklar, sırasıyla GFP veya tujuan belirteçlerini ifade eden nöral kök hücreleri gösterir. Sonuç olarak, intra-arteriyel enjeksiyon inme tedavisi için nöral kök hücrelerin teslimi için uygun bir yöntemdir. Nöral kök hücreler hayatta kalabilir ve yaralı beyin içinde farklı hücre tiplerine farklı.

Ve son olarak, intra-arteriyel enjeksiyon yöntemi burada tanıtılan da çözümler ve süspansiyonlar teslim için kullanılabilir.