Yazarlar, bu araştırmanın 760813 sayılı hibe anlaşması kapsamında AVRUPA Birliği'nin PATROLS projesi için Horizon 2020 araştırma ve yenilik programından fon aldığını kabul etmek istiyor.

<ol>
	<li>Geiser, M., Kreyling, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+biokinetics+of+inhaled+nanoparticles.">Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 7, 2 (2010).</li><li>Modrzynska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+effects+of+nanoparticle+deposition+in+the+liver.">Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver.</a> Kgs. Lyngby, Denmark: Technical University of Denmark. , (2018).</li><li>Elje, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+applied+to+HepG2+liver+spheroids.">The comet assay applied to HepG2 liver spheroids.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+the+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).</li><li>Shah, U. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+in+vitro+HepG2+cells+liver+spheroid+model+for+genotoxicity+studies.">A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 51-58 (2018).</li><li>Lauschke, V. M., Hendriks, D. F. G., Bell, C. C., Andersson, T. B., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3D+Culture+Systems+for+Studies+of+Human+Liver+Function+and+Assessments+of+the+Hepatotoxicity+of+Drugs+and+Drug+Candidates.">Novel 3D Culture Systems for Studies of Human Liver Function and Assessments of the Hepatotoxicity of Drugs and Drug Candidates.</a> Chemical Research in Toxicology. 29, 1936-1955 (2016).</li><li>van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+in+vitro+models+of+liver+fibrosis.">3D in vitro models of liver fibrosis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 121, 133-146 (2017).</li><li>Corvi, R., Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+-+can+the+performance+be+enhanced.">In vitro genotoxicity testing - can the performance be enhanced.</a> Food and Chemical Toxicology. 106, 600-608 (2017).</li><li>Doak, S. H., Manshian, B., Jenkins, G. J. S., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+strategy+for+nanomaterials+and+the+adaptation+of+current+OECD+guidelines.">In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 745, 104-111 (2012).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OECD Guidelines. Test 489: In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. , (2016).</li><li>Gerets, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocytes,+HepG2+cells,+and+HepaRG+cells+at+the+mRNA+level+and+CYP+activity+in+response+to+inducers+and+their+predictivity+for+the+detection+of+human+hepatotoxins.">Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins.</a> Cell Biology and Toxicology. 28, 69-87 (2012).</li><li>Sison-Young, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter+assessment+of+single-cell+models+aligned+to+standard+measures+of+cell+health+for+prediction+of+acute+hepatotoxicity.">A multicenter assessment of single-cell models aligned to standard measures of cell health for prediction of acute hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. 91, 1385-1400 (2017).</li><li>European Guidelines 2019. European Agency for Safety and Health at Work Available from: <a target="_blank" href="https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines">https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines</a> (2019)</li><li>Jensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NANOGENOTOX+Dispersion+Protocol+for+NANoREG.">The NANOGENOTOX Dispersion Protocol for NANoREG.</a> European Union Grant Agreement n&#176; 2009. 21, 01 (2014).</li><li>Marchese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+and+M1:+Biological+Properties+and+Their+Involvement+in+Cancer+Development.">Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development.</a> Toxins. 10, 214 (2018).</li><li>Rushing, B. R., Selim, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1:+A+review+on+metabolism,+toxicity,+occurrence+in+food,+occupational+exposure,+and+detoxification+methods.">Aflatoxin B1: A review on metabolism, toxicity, occurrence in food, occupational exposure, and detoxification methods.</a> Food and Chemical Toxicology. 124, 81-100 (2019).</li><li>Kermanizadeh, A., Brown, D. M., Moritz, W., Stone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+inter-individual+Kupffer+cell+variability+in+the+governance+of+hepatic+toxicity+in+a+3D+primary+human+liver+microtissue+model.">The importance of inter-individual Kupffer cell variability in the governance of hepatic toxicity in a 3D primary human liver microtissue model.</a> Scientific Reports. 9, 7295 (2019).</li><li>Berger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Liver+Cell+Models+Using+the+Basel+Phenotyping+Cocktail.">Comparison of Liver Cell Models Using the Basel Phenotyping Cocktail.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 443 (2016).</li><li>Ramaiahgari, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+differentiated+HepG2+cell+spheroids+with+improved+liver-like+properties+for+repeated+dose+high-throughput+toxicity+studies.">A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liver-like properties for repeated dose high-throughput toxicity studies.</a> Archives of Toxicology. , (2014).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+in+vitro+micronucleus+assay+for+evaluation+of+nanomaterials.">Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials.</a> Mutagenesis. 32 (1), 151-159 (2016).</li><li>Kirkland, D., Reeve, L., Gatehouse, D., Vanparys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+in+vitro+genotoxicity+battery+comprising+the+Ames+test+plus+the+in+vitro+micronucleus+test+is+sufficient+to+detect+rodent+carcinogens+and+in+vivo+genotoxins.">A core in vitro genotoxicity battery comprising the Ames test plus the in vitro micronucleus test is sufficient to detect rodent carcinogens and in vivo genotoxins.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 721 (1), 27-73 (2011).</li><li>Curcio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system.">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).</li><li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability,+spheroid+size,+and+hepatocellular+functions.">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).</li><li>Asthana, A., Kisaalita, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtissue+size+and+hypoxia+in+HTS+with+3D+cultures.">Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures.</a> Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).</li><li>Gaskell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+functional+C3A+liver+spheroid+model.">Characterization of a functional C3A liver spheroid model.</a> Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).</li><li>Cho, E. C., Zhang, Q., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sedimentation+and+diffusion+on+cellular+uptake+of+gold+nanoparticles.">The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).</li><li>Hinderliter, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDD:+A+computational+model+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+target+cell+dosimetry+for+in+vitro+toxicity+studies.">ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies.</a> Particle and Fiber Toxicology. 7, 36 (2010).</li><li>Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biokinetics+in+repeated-dosing+in+vitro+drug+toxicity+studies.">Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies.</a> Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

3D hepatik modeller için uygulamalar, hedeflenen belirli biyokimyasal uç noktaya veya olumsuz sonuç yoluna bağlı olarak önemli ölçüde değişir. Her modelin, birincil insan hepatosit (PHH) modellerindeki interdonor varyasyondan hücre hattı tabanlı modellerde azaltılmış sitokrom p450 aktivitesine kadar yararları ve sınırlamaları vardır, ancak hepsi kendi başına değerlidir6,12,18,19. Genotoksisiteyi değerlendirirken, aktif çoğalma gerektiğinden, in vitro mikronükleus testi gibi düzenleyici onaylı uç noktalarla uyumluluk modellerinde sınırlamalar vardır. Genotoksisite değerlendirmesi, DNA onarımının geçici lezyonları düzeltmesi için fırsat olduğunda sabit DNA hasarının hücre sonrası bölünmesinin ölçülmesini gerektirdiğinden, bu gereklidir. Ne yazık ki, son derece farklılaştırılmış hepatosit (yani, HepaRG) bazlı küreseller veya PHH mikrotizeleri, en fizyolojik olarak ilgili karaciğer benzeri özellikleri sergilediği düşünülen statik (proliferatif olmayan) modelleroluşturur 12,19,20. Sonuç olarak, burada sunulan 3D HepG2 küresel model, genotoksisite testini destekleyebilecek uygun, alternatif bir model sağlar. HepG2 hücre hattı bazlı küreseller, albümin ve üre üretimi ve bazı CYP450 aktivitesi5,12,19gibi temel karaciğer benzeri özellikleri korurken, küresellerin dış yüzeyinde yeterince aktif olarak bölünen hücrelere sahiptir. Esas olarak bu in vitro karaciğer modeli mikronükleus testini tamamlamak için geliştirilmiştir, çünkü bu genotoksisite testi için pilde önerilen iki in vitro testlerden biridir8,10,11,21. Bununla birlikte, model DNA dizileme analizi ve gen ekspresyon (RNA) teknolojilerine kolayca uygulanabilirken, kuyruklu yıldız testi gibi diğer DNA hasar uç noktaları için daha fazla uyarlanıp kullanılma potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, ENM parazitinin bazı uç nokta analizlerinde oynadığı rolü göz önünde bulundurmak önemlidir. Örneğin, akış sitometrisi bazlı analizler özellikle partikül paraziti nedeniyle ENM genotoksisite değerlendirmesi için uygun olmayabilir22.
Aktif olarak hücre bölünmesi geçiren küresel modellerin sınırlayıcı faktörlerinden biri boyutlarıdır. Modelin çoğalmaya devam etmesine izin veren yeterli hücre olması gerektiğinden, tohumlama yoğunluğunun optimizasyonu kritik öneme sahiptir; ancak çok yüksek olmayan bir hücre sayısı, bu da küreselin aşırı kompakt hale gelmesine neden olur ve nekrotik çekirdeğin artmasına neden olur. Bu nekrozun nedeninin sınırlı oksijen ve besin difüzyonu olduğuna inanılmaktadır, çünkü bu difüzyonun sınırının yaklaşık 100 – 150 μm doku23,24olduğu düşünülmektedir. Ancak, bu hücre türüne, hücre numarasına, iskele etkileşimlerine ve kültür koşullarına bağlıdır25. O zamandan beri, yaklaşık 700 μm çapının C3A sferoidlerin merkezinde nekrozun erken başlamasını önlemek için sınır olduğu gösterilmiştir, küresel başına 4000 HepG2 hücresinin tohumlaması, maruz kalma sırasında modelin çapının ≤500 μm26olmasını sağlar. Ayrıca, Shah ve arkadaşları, küresel başına 5000 hücrenin üzerinde tohumlanan HepG2 hücrelerinin, kültürde 7 gün sonra canlılıkta% 25'lik bir azalma sergilediğini ve bunun ortalama 680 μm çapına ve 20 μL asılı damla5'tebesinlerin sınırlı mevcudiyetine bağlı olabileceğini tespit etti. Bunun üstesinden gelmek için, mevcut protokolde tasarlanan model, asılan damlanın küreselin ilk oluşumunu takiben agarose kaplı kuyulara aktarıldığı kritik bir adımdan geçer. Bu, küreseller içinde sürekli artan hücre sayısını sürdürmek için daha fazla kültür ortamının mevcut olmasını sağlar. Sonuç olarak, HepG2 küresel modeli kültürde 10 gün sonra% 70'in üzerinde uygulanabilir kalır ve uzun süreli tehlike değerlendirmesi in vitro içinkullanılabilir. 
HepG2 küresel modeli hem akut hem de uzun süreli maruz kalma rejimlerini destekleyebilirken, uzun kültür dönemlerinde hücre kültürü ortamının yenilenmesi, sferoidlerin potansiyel kaybı nedeniyle ortamın tamamen değiştirilmesi tavsiye edildiği için bu model için kısıtlanır. ENM maruziyetlerinde, homojen ENM dağılımlarının aglomera ve tortuya eğiliminin yüksek olduğu varsayılmaktadır. Bununla birlikte, bir ENM çökeltilerinin parçacık parametrelerine (örneğin, boyut, şekil ve yoğunluk) bağlı olarak değişebileceği ve entrika sedimansasyonu, difüzyon ve dozimetri (ISDD) modeli veya enm (süspansiyon) maruziyeti ile ilgili olarak sıklıkla atıfta bulunulan son türevleri kullanılarak teorik olarak belirlenebileceği dikkat çekicidir27,28. Bu akılla, hücre kültürü ortamının sadece% 50'sinin hücre kültürünün yüzeyinden dikkatlice çıkarılması durumunda, ENM dozunun bozulması ve daha sonra çıkarılmasının teoride minimum olması gerektiği varsayılıyor. Bununla birlikte, Brownian hareketi söz konusu olduğunda, bu kesinlikle böyle olmayabilir ve test edilecek her bir ENM'nin birikmesi ve tortulması için daha fazla çalışma yapılmalıdır, doğru dozimetrinin uzun süreli maruz kalma rejimleri boyunca korunmasını sağlamak için27. Esas olarak bu, tekrarlanan dosing rejimlerini gerçekleştirirken göz önünde bulundurulacak potansiyel bir sınırlamadır, çünkü bu son, birikmiş konsantrasyon için kritik olabilir. Öte yandan, kimyasal bazlı maruziyetler, dikkate alınması gereken kendi sınırlamaları olmadan olmasa da, kimyasal maddelerin çözeltide kalma eğiliminde olduğu konusunda daha basit bir yaklaşım sunar ve böylece yeni eklenen konsantrasyona ek olarak orijinal kimyasal konsantrasyonun doğrudan değiştirilmesi, medya tazeleme sırasında kaybolan herhangi bir kimyasalın buna göre değiştirilmesini sağlar29. Gelecekteki uygulamalar, modelin uzun süreli kültür dönemlerinde tekrarlanan maruz kalma rejimlerine uygunluğunu değerlendirmeyi içerecektir, çünkü tekrarlanan dosing stratejileri, belirli bir organ sisteminin ksenobiyotik bir maddenin biyoakümülasyonundan kaynaklanan olumsuz etkileri iyileştirme veya üstesinden gelme yeteneğini değerlendirmek için çok önemlidir.
Sonuç olarak, bu 3D in vitro hepatik model, bir dizi gerçekçi maruz kalma senaryosunu değerlendirmek için kullanılacak kapasiteye sahiptir, böylece hem ENM'yi hem de kimyasal tehlike değerlendirmesini rutin ve kolay erişilebilir bir şekilde daha iyi desteklemek için gelecekteki bir in vitro yaklaşım sağlar.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.
Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" />
to:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" />
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;0.06 mg/mL whilst urea production should be &#8805;0.4 ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;50.0&#160;ng/&#956;L whilst urea production should be &#8805;0.25&#160;ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

İnsan tabanlı çok sayıda uygulama (örneğin, gıda, kozmetik, giyim, spor ekipmanları, elektronik, ulaşım ve tıp) genelinde çeşitli mühendislik nanomalzemelerin (ENM) hızlı gelişimi ve uygulanması nedeniyle, insanların düzenli olarak ENM'ye maruz kalmaları kaçınılmazdır. Bununla birlikte, bu malzemeleri çok sayıda uygulamada avantajlı gören yeni, boyuta özgü fizyoterapi-kimyasal özelliklerin insan sağlığı ve çevre üzerinde yan etkilere neden olabileceğine dair endişeler artmaktadır. Şu anda, bu ENM'lere fizyolojik olarak daha fazla maruziyeti aktif olarak yansıtmak ve bu malzemelerin akut, uzun süreli ve tekrarlanan düşük doz maruz kalma senaryoları üzerindeki potansiyel toksisitesini değerlendirmek için birçok uluslararası faaliyet uygulanmaktadır.
Karaciğerin MARUZ KALMA SONRASI ENM birikiminin önemli bir bölgesi olduğu yaygın olarak bilindiğinden, HEPATIK toksikoloji ENM maruziyeti göz önüne alındığında anahtardır1,2. Ayrıca, karaciğer sistemik dolaşıma giren maddelerin metabolizması ve detoksifikasyonu için birincil organ sistemidir3. 2D hepatosit modellerinin karmaşık çok hücreli etkileşimlerin karmaşıklıklarını doğru bir şekilde taklit etmediğini veya in vivo olarak gözlenen metabolik aktiviteyi uygun şekilde temsil etmediğini kabul eden anlayışa dayanarak, in vivo ikame teknolojileri için sağlam ve fizyolojik olarak ilgili in vitro 3D karaciğer modelleri geliştirmeye daha fazla odaklanılmıştır4,5. Gelişmiş 3D kültür teknolojilerinin kullanılması, uzun süreli, tekrarlanan maruz kalma rejimlerinin araştırılmasını sağlayan in vitro hepatik modellerin uzun ömürlülüğünü artırır. Ek olarak, bu gelişmiş kültür formatı, safra canaliculi, aktif taşıyıcı süreçleri ve geliştirilmiş CYP450 ilaç metabolizasyon yetenekleri gibi gelişmiş fizyolojik, organotipik özelliklerin oluşumunu teşvik eder, böylece modellerin öngörülebilirliğini artırır6. Mono-kültürlerden (sadece hepatositler) veya ortak kültürlerden (nonparenkimal hücreli hepatositler) oluşan mevcut 3D in vitro hepatik modeller çeşitli biçimlerde mevcuttur, ultra yüksek yapışma plakalarındaki mikrotissues veya sferoidlerden, asılı damla sferoidlere, matrislere ve / veya iskelelere gömülü hücrelere ve mikroakışkan hücre kültürü platformlarına kadar, hepsi hepatik toksisite değerlendirmesi için etkili gelişmiş in vitro modeller olarak kabul edilir6,7. Bununla birlikte, bu model sistemlerinin çoğu yüksek bakım gerektirir, özel ekipman gerektirir ve pahalıdır. Ayrıca, bu modeller genellikle sabit DNA hasarını ölçen yöntemleri kullanarak genotoksisite testi gibi tehlike uç noktalarının değerlendirilmesinde kullanılmasını önleyen statiktir (yani bölünmeyen hücre modelleri). Genotoksisite, düzenleyici toksikolojide temel bir ön koşuldur ve herhangi bir toksik edicinin risk değerlendirmesinin hayati bir bileşenidir8. Eksojen bir maddeye maruz kalmadan sonra ortaya çıkabilecek tüm DNA hasarı biçimlerini ölçmek için uygulanabilecek tek bir test yoktur. Bununla birlikte, in vitro genotoksisite test pilinin temel bir bileşeni, brüt kromozomal hasarı ölçen güvenilir ve çok yönlü bir teknik olan mikronükleus testidir9. OECD Test Kılavuzu 487 tarafından açıklanan, in vitro DNA hasarını ve genotoksisiteyi değerlendirmek için kullanılan altın standart bir tekniktir ve düzenleyici tehlike değerlendirmesi10,11için test pili gereksiniminin bir parçasıdır.
İnsan hepatosellüler karsinom hücre hattı, HepG2, hücreler kolayca kullanılabilir, kaynağa nispeten ucuz, kültüre basit ve yüksek verim taramasına uygun olduğu için ilk tehlike değerlendirmesi taraması için yaygın olarak kullanılır12,13. 3D küresel yapılara kültürlendiğinde, karaciğer mikroçevresini iyi bir şekilde yeniden özetledikleri ve mikronükleus testini desteklemek için yeterli proliferatif yeteneklere sahip hepatik bir model sundukları gösterilmiştir3. HepG2 küresel modellerinin daha da geliştirilmesi, uzun süreli, tekrarlanan maruz kalma rejimleri (≤14 gün) üzerinde genotoksisite tehlike değerlendirmesini desteklemek için modelin uzun ömürlülüğünü ve karaciğer benzeri işlevselliğini iyileştirmek için kurulmuştur. Böylece, 3R'lerin değiştirilmesi ilkeleri doğrultusunda, hayvan deneylerini azaltmak ve iyileştirmek için mevcut protokol, akut, uzun süreli ve tekrarlanan kimyasal ve ENM maruziyetlerini rutin ve kolay erişilebilir bir şekilde takip eden birden fazla toksikolojik uç noktayı (örneğin karaciğer işlevselliği, (pro)enflamatuar belirteçler, sitotoksiklik ve genotoksisite) güvenilir bir şekilde değerlendirebilen gelişmiş bir 3D in vitro hepatik model sağlamak için kurulmuştur.
Burada, akut veya uzun süreli, tekrarlanan ENM maruziyetlerini takiben genotoksisite tehlike değerlendirmesi için fizyolojik olarak ilgili 3D hepatosit hücre hattı tabanlı in vitro model sistemi kurmak için bir yöntem sunuyoruz. Protokol 6 temel aşamaya ayrılabilir: kriyoprezer korunmuş HepG2 hücrelerinin kült haline alınması; HepG2 küresel preparat; HepG2 sferoid asılı damladan agarose süspansiyona transfer; HepG2 küresel hasat; mikronükleus tahlil ve puanlama; ve veri analizi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1088px;" width="1088">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Aflotoxin B1</td>
			<td style="width:168px;">Sigma Aldrich, UK</td>
			<td style="width:344px;">A6636-5MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Autoclave Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BCG Albumin Assay</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>MAK124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin Powder</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell Freezing Aid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, UK</td>
			<td>5100-0001 - Mr Frosty</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytochalasin B</td>
			<td>Merck, UK</td>
			<td>250233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytology Metal Clips</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Cytospin 4 Centrifuge</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">CM00730202</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>21063-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPX Mounting Medium</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>D/5330/05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10048291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FBS</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Filter Cards for Shandon Cytospin</td>
			<td style="width:168px;">FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">15995742</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Frosted Glass Slides</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Giemsa&#39;s Stain Improved R66 Solution, Gurr</td>
			<td>VWR Chemicals, UK</td>
			<td>MFCD00081642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Glass Coverslips (24 x 60)</td>
			<td style="width:168px;">Deckglaser, VWR</td>
			<td style="width:344px;">ECN631-1575</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Haemocytometer and Coverslip</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Immersion Oil for Microscope</td>
			<td>Zeiss, UK</td>
			<td>518F, ISO8034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laminar Class II Tissue Culture Hood</td>
			<td>Scanlaf Mars</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Light Microscope</td>
			<td style="width:168px;">Zeiss, UK</td>
			<td style="width:344px;">Axiovert 40C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10284580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Non-Filtered, Sterile 200&#181;l and 1000&#181;l Pipette tips</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NuncMicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, Denmark</td>
			<td style="width:344px;">167008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P1000 and P200 micropipettes</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P300 and P50 multi-channel pipettes</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pen/Strep</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphatase Buffer Tablets</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>10582-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipette Boy</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges</td>
			<td style="width:168px;">FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">11690581</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sonifier SFX 550 240V CE 1/2&#34; - Probe</td>
			<td>Branson, USA</td>
			<td>101-063-971R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T-25 and T-75 Tissue Culture Flask</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;">T-25 (690175) and T-75 (660175)</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>T8154-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Urea Assay Kit</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>MAK006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Virkon Disinfectant</td>
			<td>DuPont, UK</td>
			<td>Rely+On Virkon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (37&#730;C)</td>
			<td>Grant JBNova 18</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Weighing Balance</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xylene</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10588070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>5300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.45&#181;m Filter Unit</td>
			<td style="width:168px;">Millex HA, MF-Millipore, UK</td>
			<td style="width:344px;">SLHA033SS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1.0mL Syringe</td>
			<td style="width:168px;">BD Plastipak, FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">300185</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps</td>
			<td style="width:168px;">DWK Life Sciences GmbH, Germany</td>
			<td style="width:344px;">WHEA986581</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">37&#730;C and 5% CO2 ISO Class 5 Hepa Filter Incubator</td>
			<td>NUAIRE DHD Autoflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">3mL Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL Conical Falcon Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL or 100mL Glass Bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL Skirted Falcon Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">5mL, 10mL and 25mL Pipettes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">9.4cm Square, Petri Dish</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;">688161</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure

Çeşitli mühendislik nanomalzemelerinin (ENM) hızlı gelişimi ve uygulanması nedeniyle, ENM'ye maruz kalmak kaçınılmazdır ve sağlam, tahmine dayalı in vitro test sistemlerinin geliştirilmesi esastır. Karaciğer metabolik homeostaz ve detoksifikasyonda hayati bir rol oynamanın yanı sıra ENM birikimi sonrası maruziyetin önemli bir yeri olduğu için, HEPATIK toksikoloji ENM maruziyeti düşünüldüğünde anahtardır. Buna ve 2D hepatosit modellerinin karmaşıklıkları doğru bir şekilde taklit etmediğinin kabul edilen anlayışına dayanarak, in vivo olarak gözlenen karmaşık çok hücreli etkileşimlerin ve metabolik aktivitenin karmaşıklıklarını taklit etmemektedir, enm tehlike değerlendirme amaçları için uyarlanmış fizyolojik olarak ilgili 3D karaciğer modellerinin geliştirilmesine daha fazla odaklanılmıştır. Hayvan deneylerini değiştirmek, azaltmak ve iyileştirmek için 3R'lerin ilkeleri doğrultusunda, hem genişletilmiş hem de tekrarlanan ENM maruz kalma rejimlerini (≤14 gün) destekleyebilen kullanıcı dostu, uygun maliyetli bir sistem olan 3D HepG2 hücre hattı tabanlı bir karaciğer modeli geliştirilmiştir. Bu küresel modeller (çapı ≥500 μm) proliferatif kapasitelerini korur (yani hücre modellerini böler) genotoksisite in vitro'yu etkili bir şekilde değerlendirmek için 'altın standart' mikronükleus testi ile birleştirilmiş olmalarını sağlar. Bir dizi toksikolojik uç nokta (örneğin, karaciğer fonksiyonu, (pro-)inflamatuar yanıt, sitotoksiklik ve genotoksisite) hakkında rapor verme yetenekleri, hem akut (24 saat) hem de uzun süreli (120 h) maruz kalma rejimlerinde çeşitli ENM'ler kullanılarak karakterize edilmiştir. Bu 3D in vitro hepatik model, daha gerçekçi ENM maruziyetlerini değerlendirmek için kullanılacak kapasiteye sahiptir, böylece ENM tehlike değerlendirmesini rutin ve kolay erişilebilir bir şekilde daha iyi desteklemek için gelecekteki bir in vitro yaklaşım sağlar.

Bu hücre hattı bazlı 3D karaciğer sferoid modelinin uzun süreli kültür ve genotoksik tehlike değerlendirmesi için uygunluğu, modelin kültürde 14 gün boyunca uygulanabilirliğini ve mikronükleus testine uygulanabilirliğini belirlemek için temel karakterizasyon yapılarak değerlendirildi.
3D HepG2 Karaciğer Küresel Modelinin Temel Karakterizasyonu Herhangi bir in vitro toksikolojik değerlendirmeden önce, agarose transferi veya kimyasal / ENM tedavisini gerçekleştirmeden önce 3D HepG2 sferoidlerinin düzgün bir şekilde oluşmuş olup olmadığını kontrol etmek önemlidir. Asılı bırakma yöntemi kullanılarak üretilen HepG2 küresellerinin, Şekil 5A-5C'degösterildiği gibi ortalama çapı 495,52 μm W x 482,69 μm H olan kompakt, küresel şekilli küresel sferoidler oluşturması genellikle tohumlama sonrası 2 - 3 gün sürer (4000 hücre/küresel). Doğru oluşmuş ve in vitro toksikolojik değerlendirmede kullanılması kabul edilebilir olan HepG2 sferoidleri, pürüzsüz bir yüzeye sahip ve görsel projeksiyonları olmayan kompakt, küresel şekilli bir yapıya sahip olmalıdır. Şekil 5, kaliteli (Şekil 5D-F) ve düşük kalite (Şekil 5G-I) sferoid örnekleri sağlar. İkincisi atılmalıdır. Tipik olarak, plaka başına oluşan küresellerin% 90-95'i doğru şekilde oluşacak ve daha fazla deney için uygun olacaktır.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> Şekil 5: Asılı bırakma yöntemi ile oluşturulan HepG2 sferoidlerinin doğal morfolojisini gösteren ışık mikroskopi görüntüleri. (A-C) gösteri Gün 2 ve (D-I) Gün 4 HepG2 karaciğer sferoidleri tohumlama sonrası. (D-F) kaliteli HepG2 küresellerine örnektir, (G-I) ise kötü biçimlendirilmiş küreseller gösterir. Tüm görüntüler mikroskop kullanılarak X20 hedefiyle çekildi. Ölçek çubuğu 20 μm'yi temsil <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">eder.</a>
HepG2 küresel canlılığını daha da doğrulamak için, karaciğer benzeri işlevlerini değerlendirmek için temel bir kolorimetrik Bromocresol Green Albumin (BCG) Tahlil veya Üre Tahlil yapılabilir. Karaciğer benzeri işlevsellik, karaciğer küresel modelinin uzun ömürlülüğünü belirlemek ve uzun süreli veya tekrarlanan ENM/ kimyasal bazlı tehlike değerlendirmesini destekleyip destekleyemeyeceğini belirlemek için 14 günlük bir kültür süresi boyunca Trypan Blue Exclusion Tahlil kullanılarak uygulanabilirlik doğrultusunda değerlendirildi (Şekil 6). Albümin konsantrasyonu kültür dönemi boyunca tutarlı kaldı. Üre üretimi, 7. 3D HepG2 sferoidlerde üretilen albümin ve üre seviyelerinin, 2D formatında kültürlenen aynı hücre hattında gözlemlenenden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu belirtmek önemlidir. Nitekim HepG2 hücrelerinin 2D kültürleri, pik albümin ve üre düzeyleri sırasıyla 0.001 mg/mL ve 0.010 ng/μL olarak sıralandı. Ayrıca, Shah ve ark. tarafından neredeyse aynı hepg2 sferoid sistemi kullanılarak yayınlanan önceki çalışmalarında, yazarlar 2D kültürlü HepG2 hücrelerine kıyasla 3D HepG2 in vitro model sistemlerinde metabolik aktivitede (CYP1A1 ve CYP1A2) önemli bir iyileşme olduğunu vurgulamaktadır5.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> Şekil 6: HepG2 karaciğer sferoidleri için 14 Günlük temel karakterizasyon verileri. Asılı düşüşten transfer edildiktan sonra, (A) HepG2 küresel modelinin 14 günlük bir süre boyunca uygulanabilirliğini vurgularken, (B) ve (C) sırasıyla karaciğer benzeri albümin ve üre işlevselliğini vurgular. SEM'± sunulan ortalama veriler, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Nekrotik bir çekirdeğin kaçınılmaz gelişimi, 3D karaciğer sferoid kültürlerinin bilinen bir sınırlaması ile, mikronükleus testini desteklemek için gereken proliferatif yeteneği korurken uzun süreli (5-10 gün) maruz kalma rejimlerini sürdürebildiğini göstermek için bu HepG2 tabanlı modelin uygulanabilirliği oluşturulmalıdır5. Gerçekten de, bu 3D karaciğer sferoid modelinin kültürde 10 gün boyunca %70 canlılığı koruduğu gösterilmiştir. Buna dayanarak ve ≥14 günlük kültür döneminde gözlenen sürekli karaciğer benzeri işlevsellikle birlikte, bu 3D karaciğer küresel modeli böylece 10 güne kadar uzun süreli, tekrarlanan ENM maruz kalma rejimlerini destekleyebilir (yani, küresellerin yaşayabilirliği% 70'in altına düşmeden önce). Referans olarak, 4000 hücrede/sferoidde tohumlanan HepG2 sferoidleri için albümin seviyelerinin 20,0 ng/μL ≥ olması, üre üretiminin ise bu modelle in vitro toksikolojik değerlendirme yapmadan önce 0,25 ng/μL ≥ olması önerilir.
Mühendislik Nanomalzemelerinin Genotoksisite Değerlendirmesi Genotoksisite değerlendirmesi için mikronükleus tahlili hem akut (24 saat) hem de uzun süreli (120 h) ENM maruziyetlerini takiben mikronüklei varlığını belirlemek için kullanıldı. Aflatoksin B1 bilinen bir karaciğer kanserojenidir16,17 ve mikronükleus tahlil için önerilen bir pozitif kontroldür. Optimizasyon deneyleri, 0.1 μM Alfatoksin B1'in 3D HepG2 karaciğer sferoidlerinde önemli bir pozitif (≥2.0 kat artış) genotoksik yanıt verdiğini ve bu nedenle bu modelle yapılan her mikronükleus testinde kullanıldığını göstermiştir. HepG2 küresel modeli kullanılarak yapılan mikronükleus test sonuçlarının geçerliliğini sağlamak için, bu 3D in vitro modelde kullanılan HepG2 hücreleri için arka plan mikronükleus frekansı% 0.6 –% 1.2 aralığında olmalıdır. Sonuç olarak, Alfatoksin B1, negatif kontrolde görülenden en az iki kat daha yüksek bir genotoksik yanıt vermelidir; böylece, 0.1 μM Alfatoksin B1% 1.5 -% 3.0 arasında bir mikronüklei frekansı indüklemelidir. Bu kontrol parametreleri kullanılarak, ENM ilişkili genotoksisite in vitro daha sonra güvenilir bir şekilde değerlendirilebilir. OECD Test Kılavuzu 487'ye dayanarak, bir ENM veya kimyasalı test ederken, seçilen konsantrasyonların% 55'ten fazla ±% 5 sitotoksisiteye neden olmaması gerektiğini belirtmek önemlidir (negatif kontrol ile ilgili olarak CPBI veya RVCC değerlerinde bir azalma ile gösterilir)11. Şekil 7, Aflatoksin B1 ve iki ENM (titanyum dioksit (TiO2)ve dilimleme (Ag)) HepG2 sferoidlerinde hem akut hem de uzun süreli maruziyetleri takiben değerlendirildiğinde ve daha sonra genotoksik potansiyel mikronükleus tahlili kullanılarak analiz edildiğinde elde edilen verileri göstermektedir. Değerlendirilen her iki ENM de akut (24 saat) maruz kalma ve uzun süreli (120 h) maruz kalma rejimi üzerinden noncytotoxic, düşük dozda 5.00 μg/mL'de test edildi. Hem TiO2 hem de Ag ENM'lerde genotoksisite için benzer bir eğilim gözlenebilir, böylece 24 saat maruz kalmanın ardından ortaya çıkan yüksek genotoksisite yanıtı uzun süreli 5 günlük maruziyet sonrasında belirgin değildi. Bu, her iki zaman noktasında aflatoksin B1 pozitif kontrolünün neden olduğu sürekli genotoksisiteye rağmen oldu.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> Şekil 7: TiO2 ve Ag ENM maruziyetini takiben Genotoksisite değerlendirmesi HepG2 karaciğer sferoidleriüzerinde. TiO2 ve Ag ENM'nin 5.00 μg/mL'sine uzun süreli (120 saat) maruziyette mikronükleus tahlil direği (A) akut (24 saat) ve(B) kullanılarak genotoksisite (mikronükleus sıklığı) değerlendirmesi. Negatif kontrol sadece bir ortamdır, pozitif kontrol ise 0.1 μM Aflatoksin B1'dir. SD. Negatif kontrolle ilgili olarak belirtilen anlam ± sunulan ortalama veriler (n=2) : * = s≤ 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure at JoVE.com

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Bu prosedür, hem akut hem de uzun süreli, tekrarlanan doz rejimleri üzerinde nanomalzeme maruziyetleri ile ilişkili genotoksik tehlikelerin fizyolojik olarak daha ilgili bir değerlendirmesini sağlayabilen ileri 3D hepatik kültürlerin in vitro geliştirilmesi için kullanılmak üzere kurulmuştur.

Uzun Süreli Nanomalzeme Maruziyetini Takiben İn vitro Genotoksisite Testi için Gelişmiş 3D Karaciğer Modelleri

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.6K Görüntüleme.  Swansea University Medical School. Bu prosedür, hem akut hem de uzun süreli, tekrarlanan doz rejimleri üzerinde nanomalzeme maruziyetleri ile ilişkili genotoksik tehlikelerin fizyolojik olarak daha ilgili bir değerlendirmesini sağlayabilen ileri 3D hepatik kültürlerin in vitro geliştirilmesi için kullanılmak üzere kurulmuştur.

Video: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

Zehirli İnhale Kimyasal Test in vitro Hücre Kültürü Modeli

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Biyomühendislik

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer. To understand the underlying mechanisms of disease development, it would be important to examine the impact of CS exposure directly on lung tissues. However, this approach is difficult to implement in epidemiological studies because lung tissue sampling is complex and invasive. Alternatively, tissue culture models can facilitate the assessment of exposure impacts on the lung tissue. Submerged 2D cell cultures, such as normal human bronchial epithelial (NHBE) cell cultures, have traditionally been used for this purpose. However, they cannot be exposed directly to smoke in a similar manner to the in vivo exposure situation. Recently developed 3D tissue culture models better reflect the in vivo situation because they can be cultured at the air-liquid interface (ALI). Their basal sides are immersed in the culture medium; whereas, their apical sides are exposed to air. Moreover, organotypic tissue cultures that contain different type of cells, better represent the physiology of the tissue in vivo. In this work, the utilization of an in vitro exposure system to expose human organotypic bronchial and nasal tissue models to mainstream CS is demonstrated. Ciliary beating frequency and the activity of cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 were measured to assess functional impacts of CS on the tissues. Furthermore, to examine CS-induced alterations at the molecular level, gene expression profiles were generated from the tissues following exposure. A slight increase in CYP1A1/1B1 activity was observed in CS-exposed tissues compared with air-exposed tissues. A network-and transcriptomics-based systems biology approach was sufficiently robust to demonstrate CS-induced alterations of xenobiotic metabolism that were similar to those observed in the bronchial and nasal epithelial cells obtained from smokers.

The aim of this protocol is to expose human organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream cigarette smoke (CS) at the air-liquid interface. The impact of CS on the tissues is then investigated using a cytochrome P450 activity assay, a cilia beating measurement, and a systems biology approach.

Tüm Sigara Dumanına Organotipik 3D Bronşiyal ve Burun Doku Kültürü Modelleri Tekrarlanan Pozlama Etki Değerlendirmesi

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Çok organ Chip - Uzun vadeli Çok doku kokültürü için mikroakışkan Platformu

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Geliştirilmesi 2D ve 3D Cilt<em&gt; İn Vitro</emMakromoleküler Dışlamasını Kullanma&gt; Modeller

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

Angiogenez Multiphoton mikroskobu In Vivo genetiği değiştirilmiş 3D-PLGA/nHAp İskele tarafından grefti kritik Kemik defekti tamir için görselleştirme

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Zebra balığı larva geliştirilmiş deneysel manipülasyon için uzun vadeli canlı görüntüleme aygıtı

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

Geliştirilmiş 3D hidrojel Neuroinflammation Vitro modelleme için birincil gliyal hücreler kültürleri

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its complex nature, and its diverse association with mammalian components. The goal of this protocol is to culture the gut microbiota in vitro, which allows for the study of the gut microbiota dynamics, without having to consider the contribution of the mammalian milieu. Using in vitro culturing technology, the physiological conditions of the gastro intestinal tract are simulated, including parameters such as pH, temperature, anaerobiosis, and transit time. The intestinal surface of the colon is simulated by adding mucin-coated carriers, creating a mucosal phase, and adding further dimension. The gut microbiota is introduced by inoculating with the human fecal material. Upon inoculation with this complex mixture of bacteria, specific microbes are enriched in the different longitudinal (ascending, transverse and descending colons) and transversal (luminal and mucosal) environments of the in vitro model. It is crucial to allow the system to reach a steady state, in which the community and the metabolites produced remain stable. The experimental results in this manuscript demonstrate how the inoculated gut microbiota community develops into a stable community over time. Once steady state is achieved, the system can be used to analyze bacterial interactions and community functions or to test the effects of any additives on the gut microbiota, such as food, food components, or pharmaceuticals.

Here, we present a protocol for culturing the gut microbiota of the colon in vitro, using a series of bioreactors that simulate the physiological conditions of the gastro intestinal tract.

Uygulama gelişmiş teknoloji insan Gut Microbiota Eğitim Kültür Vitro

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

Akış Altında Damar İlacı Hedeflemesi Üzerinde Çalışmak için In Vitro 3D Hücre Kültürlü Arteriyel Modeller

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

Methods Article

Uzun Süreli Nanomalzeme Maruziyetini Takiben İn vitro Genotoksisite Testi için Gelişmiş 3D Karaciğer Modelleri