Otolog kaynaklar kullanılarak insan karaciğer sferoidlerinin üretilmesi, toksikoloji, kanser ve ilaç keşfi gibi çeşitli araştırma alanlarına katkıda bulunabilir. Bu tekniğin temel avantajı, birincil insan hepatositlerinin veya PHH'nin eksikliğini gidererek, insan karaciğer sferoidlerini mühendislik yapmak için BDPC türevi insan hepatositlerini kullanmaktır. Otolog insan sferoidleri, özellikle akut karaciğer yetmezliği olan hastalarda rejeneratif tıp ve tedaviye genişletilebilir.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımdaki proje lideri Dr. Anne-Katherin Schott olacak. 500 mililitre hepatoblast KnockOut serum replasman dimetil sülfoksit veya KSR DMSO ortamı ve hepatosit olgunlaşma ortamı hazırlayarak başlayın. Ortamı stoktan alın ve her ortam değişimi için mililitre başına 10 veya 20 nanogramlık son konsantrasyonlarda taze hepatosit büyüme faktörü veya HGF ve onkostatin M veya OCM ekleyin.
Beşinci kandan türetilmiş pluripotent kök hücrelere veya BD-PSC hücrelerine üç kez 10 ila biyolaminin kaplı dört kuyucuklu bir plakaya aktarın ve plakayı beş gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatörde inkübe edin. Endodermal farklılaşmayı desteklemek için, hücreleri KSR DMSO hepatoblast ortamında beş gün boyunca kültüre alın ve ortamı her 48 saatte bir değiştirin. Beşinci günde, hepatosit olgunlaşma ortamı ekleyin ve hücreleri inkübatörde 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte yedi ila 10 gün daha kültüre alarak ortamın her 48 saatte bir değişmesini sağlayın.
Bir sayım odası kullanarak hücreleri sayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 G'de BD farklılaştırılmış hücre süspansiyonunu santrifüj yapın. Süpernatanı çıkardıktan sonra, KSR DMSO ortamındaki BD farklılaştırılmış hücreleri, mililitre konsantrasyon başına altı hücrenin iki katı 10'unda yeniden askıya alın. Tek hücreli süspansiyonu sağladıktan sonra, hücreleri 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirerek ek kalıntıları temizleyin.
Yine, bir sayım odası kullanarak hücreleri sayın ve kuyucuk başına gerekli hacmi dağıtmak için her hücre tohumlama yoğunluğunun yeterli bir hacmini hazırlayın. 4.000 hücrelik düşük bir tohumlama yoğunluğuna bir milyon hücrenin üst tohumlanmasıyla bir gradyan hazırlayın. Daha sonra, 96 delikli düşük bağlantı plakalarına 100 mikrolitre KSR DMSO ortamı dağıtın ve 100 mikrolitre hücre tohumlama seyreltmesi ekleyin.
Düşük bağlantı plakasını beş gün boyunca inkübe edin. Sferoidler yeterince kompakt olduğunda, tohumlamadan sonraki üçüncü veya dördüncü günde ortamın% 50'sini değiştirin. Beşinci günde, ortamı hepatosit olgunlaşma ortamına değiştirin ve içindeki hücreleri yedi ila 10 gün daha kültüre alın ve ortamı her 48 saatte bir değiştirin.
Daha önce açıklanan farklılaştırma yöntemini kullanarak hücreleri 4, 8, 15 ve 24 gün boyunca kültüre aldıktan sonra, ortamı çıkarın. PBS'de% 4 paraformaldehit içeren önceden ısıtılmış fiksatif ile hücreleri 10 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, fiksatifi atın ve hücreleri her biri beş dakika boyunca iki kez PBS ile yıkayın.
Hemen% 0.1 Triton X-100 çözeltisi ekleyin ve iki PBS yıkamadan önce hücreleri beş dakika geçirgenleştirin. Hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca bir rocker plakasına yerleştirmeden önce PBS ve% 5 sığır serum albümininden veya BSA'dan yapılmış bir bloke edici çözelti ekleyin. Seyreltme tamponunda% 1 BSA PBS'de birincil antikorları seyreltin ve kuyucuk başına 50 mikrolitre antikor seyreltmesi ekleyin.
Oda sıcaklığında bir saatlik bir inkübasyondan sonra antikor çözeltisini atın ve PBS kullanarak her biri beş dakikalık üç yıkama yapın. Her bir kuyucuğa seyreltme tamponunda seyreltilmiş 50 mikrolitre ikincil antikor ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Hücreleri PBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkadıktan sonra, mikroskobik analiz için kapakları DAPI içeren montaj ortamıyla monte edin.
Kültür ortamını sferoidlere dokunmadan dikkatlice atın ve% 0.1 Triton X-100 çözeltisi ile taze hazırlanmış PBS ekleyin ve hücreleri geçirgenleştirmek için beş dakika inkübe edin. Sferoidleri, ortamı yavaşça pipetleyerek ortamla iki kez yıkayın. Daha sonra, sferoidleri bir saat boyunca 50 mikrolitre birincil antikor ile inkübe edin.
Tamamlandığında, fazla antikor çözeltisini dikkatlice çıkarın ve üç kez orta yıkama yapın. PBS'de keçi karşıtı fare IgG Cy3, keçi karşıtı fare IgG 488 ve tavşan anti-tavuk IgG Texas Red gibi ilgili ikincil antikorları% 1 BSA ile hazırlayın ve karbondioksit inkübatöründe 20 dakikalık inkübasyondan önce kuyu başına 50 mikrolitre antikor seyreltmesi ekleyin. Yine, inkübatörde 30 dakikalık inkübasyondan önce ortamla üç kez yıkayın.
Floresan ışık kaynağını kullanmadan 10 dakika önce açın. Bilgisayarı açın ve görüntüleme yazılımını açın. Doğru ölçek çubuğunu seçmek için araç çubuğundaki 4X düğmesine tıklayarak 4X büyütme hedefini kullanın.
Ardından 96 delikli plakayı sahne orta plakasına yerleştirin. LED ışık kaynağını açın, parlak alan filtresini kullanın ve XY ekseni sahne alanı ayar düğmesini kullanarak plakayı ilgilendiğiniz kuyuya yerleştirin. Kamera ışık yoluna geçin ve ekrandaki görüntüyü görselleştirmek için görüntüleme yazılımındaki canlı düğmeye tıklayın.
XY eksen düğmeleri kullanılarak sferoidin ortalandığından emin olun ve kaba veya ince odaklama düğmesini kullanarak odaklanın. Ardından, araç çubuğunda parlak alan gözlem yöntemini seçin, pozlama ayarlarını otomatik konuma getirin ve fotoğraf çekmek için kamera kontrol panelindeki anlık görüntü düğmesini tıklatın. Ardından, ilgilendiğiniz klasördeki uygun adı kullanarak resmi vsi dosyası olarak kaydedin.
LED ışığını kapatmak için ortam ışığı koruma plakasını yerleştirin ve filtreyi B uyarımı için değiştirin. Ardından 488 gözlem yöntemini seçin. Deklanşörü açın, anlık görüntü düğmesine tıklayarak bir resim çekin ve deklanşörü kapatın ve dosyayı vsi olarak kaydedin.
İlgilenilen her kuyu için işlemi yinelemek üzere G uyarımı için bir filtreyle işlemi tekrarlayın. Hepatik farklılaşma sürecindeki morfolojik değişiklikler, BD-PSC'lerin üç aşamada hepatositlere farklılaştığını göstermiştir. İlk aşama endodermal hücrelere farklılaşmayı temsil ediyordu.
Tipik bir poligonal morfoloji sergileyen hepatik progenitör hücrelere ikinci farklılaşma. Ve üçüncüsü, hepatositlere olgunlaşma. İmmünofloresan analizi, L4 ila L8 günlerinde hepatik farklılaşma sürecinin ilk aşamasında hücrelerde alfa fetoprotein veya APF ve transtiretin veya TTR gibi endoderm insan karaciğer progenitör belirteçlerinin güçlü ekspresyonunu göstermiştir.
Bununla birlikte, ifadeleri L15 gününde azaldı. Albümin veya ALB ve hepatosit nükleer faktör dört alfa veya HNF4 alfanın ekspresyonu ilk olarak L4'te ortaya çıktı, L4'ten L15'e farklılaşma süresi boyunca arttı ve L15'ten L24'e olgunlaşma süresi boyunca güçlü ve kararlı bir ifadeye ulaştı. Hepatosit indüksiyonu veya matürasyon ortamı ile başlayan sferoid oluşumu içeren düşük ataşman plakalarında hücrelerin spontan agregasyonu gözlendi.
Steroid sferoid ile değişken hücre sayısı arasında tutarlı bir korelasyon gözlendi. L14'te oluşan ve farklılaşan sferoidler ve antikorlarla boyanmış canlılar, BD-PSC'lerden türetilen sferoidlerin potansiyel hepatik fonksiyonel aktivitesini ortaya koymuştur. Mononükleer hücrelerin yeniden programlanması için hazırlanması bu prosedürdeki en önemli adımdır.
İnsan karaciğer sferoidleri üretmek, in vivo'ya benzer mikro anatomiye sahip organoidlerin in vitro basitleştirilmiş versiyonunu 3D olarak oluşturmanın ilk adımıdır. Laboratuvarda oluşturulan organoidler, organogenez, hastalık gelişimi ve besinleri incelemek için kullanılır.
