Bu protokol, çift iplikçikli DNA kırılmaları ile sonuçlanan, kinetik hakkında ayrıntılı nicel veriler sağlayan herhangi bir işleme uygulanabilir. Bu yöntem tek molekül çözünürlüğüne sahip olmasına rağmen, tek bir deneyde 1000 DNA'ya kadar ölçer ve böylece iyi istatistikler sağlar. Bu yöntemin birincil uygulaması DNA bağlama ve modifikasyon ile ilgili mekanizmaları incelemektir.
Örneğin, tüm DNA bağlayıcı proteinlerle ilgili DNA hedef aramasını incelemek le ilgileniyoruz. Bu tekniği ilk kez denerken, tek moleküllü teterlerin hassas olduğunu ve bir kez form un dikkatli bir şekilde ele alınması gerektiğini unutmayın. İşlevselleştirilmiş yüzeylerin doğru oranı esastır.
Akışı yapmak için birkaç püf noktaları vardır. Veri toplama sırasında örnek tüpleri değiştirmenin yanı sıra, görsel gösteri bu yordamda yeni olan birine yardımcı olabilir. Kapak fişleri yıkamak için, boyama kavanoz yerleştirin ve 30 dakika etanol ile sonicate.
Iyice deiyonize ve distile su ile durulayın, sonra bir azı lı potasyum hidroksit onları batırın ve 30 dakika daha sonicate. Yıkama sırasını tekrarlayın, her yıkamadan sonra kapak kaymasını suyla durulayın. Temizlenmiş kapak fişlerini boya kavanozlarında su yla birlikte saklayın.
Sekiz santimetre uzunluğundaki yükleme ve çıkış tüplerini kesmek ve temiz bir cam kaydıraktaki deliklere yerleştirmek için temiz bir jilet kullanın. Epoksi tüp ve güvenli beş dakika boyunca tedavi sağlar. Cam slaytlar için kanal deseni ile çift taraflı bant önceden kesilmiş uygulayın ve iyi bir mühür elde etmek için plastik çifenler ile pürüzsüz.
Teyp ten geri soyma ve temiz bir kapak kayma uygulayın, forceps ile yumuşatma. Daha sonra, epoksi kapak kenarı akış hücre mühür ve tedavi sağlar kayma. El yazması talimatlara göre PCR gerçekleştirerek tethering için etiketli DNA hazırlayın.
Ardından PCR ürününü PCR temizleme kitiyle temizle 10 mililitre tampon A hazırlayın ve vakum lu kurutucuda en az bir saat gazlayın. Akış hücresini işlevselleştirmek için, PE60 borusu içine sığacak bir jel yükleme ucu kullanarak, PBS anti-digoksigenin ve fab parçaları 25 mikrolitre enjekte akış kanalına.
Akış hücresini oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, 0,5 mililitre lik tampon A'yı şırınga ile kanaldan geçirin ve kanala hava sokmamaya özen çekin. Sonra, ters bir mikroskop üzerinde akış hücresi dağ.
Çıkış tüpünü şırınga pompasına bağlayın ve giriş tüpünü tampon A içeren mikro bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Daha sonra pompa sistemi dengelemek için en az beş dakika boyunca dakikada 10 mikrolitre çalışmasına izin verin. Girdap boncuk stok şişe, ve pipet 1.6 mikrolitre boncuk tampon A 50 mikrolitre içine, sonra tekrar girdap.
Boncukları manyetik ayırıcıya ve pipete tamponun dışına yerleştirin. 50 mikrolitre tampon A'da tekrar askıya alın ve girdap haline getirin. Son yıkamadan sonra, mililitre başına 160 mikrogram lık son konsantrasyon için 100 mikrolitre tampon A'daki boncukları yeniden askıya alın.
Tampon A'da 0,5 picomolar etiketli DNA substratı ve seyreltilmiş DNA'ya 20 mikrolitre boncuk süspansiyonu pipet içip 480 mikrolitre hazırlayın. Karışımı üç dakika rotator üzerine yerleştirin. Üç dakika sonra, numuneyi dakikada 10 mikrolitrelik bir akış hızıyla 15 dakika veya yeterli boncuk tethering işeyinceye kadar hemen kanala yükleyin.
Giriş tüpünü yeni bir tampon A tüpüne çevirerek ve dakikada 50 mikrolitre de en az 10 dakika veya gevşek boncuk lar gözlemlenmeyene kadar akarak tüm ücretsiz boncukların kanalını yıkayın. Ve akışı kesmek ve boru geçiş için bir satır lı vana kullanmak yararlıdır. Boruları tek bir düzgün hareketle değiştirin ve geri akışı önlemek için yeni ve eski numune tüplerindeki sıvı seviyelerinin eşleştirdiğinden emin olun.
Veri toplamadan önce, DNA bölünme enziminin doğru konsantrasyonuna hazırlayın ve giriş tüpünü numuneye takın. Mıknatısı akış hücresi nin üzerine indirin. Pompayı dakikada 150 mikrolitre numune enjekte etmeye ve veri toplamaya başlayacak şekilde ayarlayın.
Veri toplamaya bir dakika, pompayı çalıştırın. Burada gösterilen tepki öncesi ve sonrası bağlı boncuk temsili bir görüntüdür. Dekolte reaksiyonu boyunca bağlı kalan boncuk sayısını ölçmek için veri analizi yapıldı.
Bu teknik, mililitrebaşına 0,25 ila dört birim arasında değişen protein konsantrasyonları ve iki farklı magnezyum konsantrasyonu için Nde1'in bölgeye özgü DNA bölünme oranlarını ölçmek için kullanılmıştır. Her durum en az iki kez çoğaltıldı, deney başına birkaç 100 ila 1000 bağlı DNA ile. Yeterince düşük protein konsantrasyonlarında, oranı protein ile orantılı ve magnezyum bağımsızdır.
Yüksek protein konsantrasyonları için, oranı magnezyum bağlıdır, ancak protein konsantrasyonu bağımsız. Bu protokolü denerken, tüp ve akış kanalındaki hava kabarcıklarının deneyi çalıştırabileceğini unutmayın. Boruyu değiştirirken hatlara hava girmesine izin vermemeye ve kullanmadan önce tüm arabellekleri gazdan arındırmaya devam edin.
Tethering yöntemi bir reaksiyon üzerinde DNA gerginliği etkisini keşfetmek için izin verir. Bu, mıknatısın mukavemetinin değişmesi veya veri toplama sırasında akış uygulanması ile elde edilebilir.
