Bizimki gibi sağlam bir plaka okuyucu testi, potansiyel metiltransferaz inhibitörlerinin ilk taraması için çok yararlıdır. Gerçek zamanlı olarak veri toplama yeteneği, sürekli endonükleaz bağlantılı tahlilin büyük bir avantajıdır. Buz üzerindeki mikrosantrifüj tüplerinde ayrı ayrı 20 mikromolar ve 50 mikromolar bileşik içeren tahlil koşullarının 600 mikrolitresini hazırlayarak başlayın.
Bunu yapmak için, son 1X metilasyon tamponu konsantrasyonunu elde etmek için her tüpe çift damıtılmış su ve 5X metilasyon tamponu ekleyin. Daha sonra, her numuneye mililitre sığır serum albümini veya BSA başına 3.15 mikrolitre 20 miligram ekleyin. Daha sonra, her numuneye iki mikrolitre 3.15 mikromolar saç tokası DNA substratı ve 1.33 mikrolitre 4.75 mikromolar S-adenosilmetiyonin veya SAM ekleyin.
21 mikromolar veya 52.5 mikromolar nihai konsantrasyon ve eşdeğer miktarda dimetil sülfoksit veya DMSO elde etmek için uygun numunelere inhibitör ekleyin ve çözeltileri üç saniye boyunca dakikada 3.000 rotasyonda vorteksleme ile karıştırmadan önce bir kontrol numunesine ekleyin. Ardından, çözeltinin tüpün dibinde toplandığından emin olmak için numuneleri bir masa masası mini santrifüjünde 1.200 kat G'de birkaç saniye döndürün. Aliquot Her tahlil çözeltisinin 95 mikrolitresi, siyah bir yarım alan 96 kuyu plakasında altı ardışık kuyuya dönüşür.
Mikrosantrifüj tüplerinde 75 mikrolitre Gla I veya DNMT1 artı Gla I enzim çözeltisini, daha önce açıklandığı gibi bir kerelik tamponun son konsantrasyonuna hazırlayın. Daha sonra, mikrolitre başına 0.16 birimlik bir nihai konsantrasyon elde etmek için her çözeltiye mikrolitre Gla I başına 1.2 mikrolitre 10 birim ekleyin. 40 nanomolar'lık son konsantrasyon için DNMT1 artı Gla I çözeltisine DNMT1'den yoksun beş mikromolar RFTS'den 0.6 mikrolitre ekleyin.
Nazik karıştırmadan sonra, çözeltinin tüpün dibinde toplandığından emin olmak için numuneleri 1.200 G'de bir masa üstü mini santrifüjde birkaç saniye döndürün. Daha sonra, her enzim çözeltisinin 12 mikrolitresini, konik tabanlı 96 kuyucuklu bir plakada altı kuyucuk içine aliquot. DNA örneğinin metilasyon testi için, plaka okuyucuyu 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın.
Ardından, tahlil çözeltilerini içeren siyah plakayı plaka okuyucuya yerleştirin. Plakayı 425 CPM'de salladıktan sonra, floresanı 485 nanometre uyarma dalga boyu ve 528 nanometre emisyon dalga boyu ile ölçün. Ardından, plakayı beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Tahlil plakasını plaka okuyucusundan çıkarın ve her bir oyuğa beş mikrolitre enzim çözeltisi ekleyin, ardından çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve floresanı 30 dakika boyunca her 53 saniyede bir kaydetmeden önce plakayı sallayın. Her koşul için üçlü Gla I kontrol tahlillerinin ortalama floresansını elde edin ve RFTS eksikliği olan DNMT1 varlığında elde edilen üçlü izlerden kontrol reaksiyonu tepsileri içeren ortalama Gla I değerini çıkarın.
Ardından, düzeltilen çoğaltmalar için ortalamanın ortalama ve standart hatasını belirleyin. Ortalama düzeltilmiş reaksiyon izini çizin ve başlangıç hızını belirlemek için ilk doğrusal kısmı bir çizgiye sığdırın. Bir bileşiğin varlığında gözlenen hızı, kontrol reaksiyonunu içeren DMSO'da gözlenen hıza bölerek ve 100 ile çarparak yüzde aktivitesini belirleyin.
Süreksiz bir endonükleaz kuplajlı tahlilin sonuçları, tamamen metillenmiş ürün DNA'sının bölünmeden korunduğunu ve RFTS'den yoksun DNMT1'in aktif olduğunu ve hemimetillenmiş substrat DNA'sını metilleştirebildiğini doğruladı. Floresan bazlı tahlilde, Gla I'in yokluğunda, DNMT1 veya tamponun eklenmesi tek başına arka plan floresansını etkilemedi. Gla I'in tüm tahlillere daha sonra eklenmesi, yalnızca DNMT1 içeren tahlillerde floresan üretimi ile sonuçlandı.
RFTS eksikliği olan DNMT1 ve Gla I'in üç tahlil için eşzamanlı olarak eklenmesi, sağlam floresan üretimi ile sonuçlandı. Gla I'in eklenmesi tek başına floresan üretmedi. Potansiyel inhibitörleri taramak için, RFTS'den yoksun DNMT1'in DNA metilasyon aktivitesi, 20 ve 50 mikromolar konsantrasyonlarda DMSO, bileşik bir, bileşik iki veya bileşik üç varlığında incelenmiştir.
Bu birleştirilmiş tahlilde floresan üretimini azaltan bileşikler daha da doğrulanmalıdır. Bileşiklerin bağlantı enzimini inhibe etmediğinden emin olmak önemli bir sonraki adımdır.
