Bu çalışma Çin Bilimler Akademisi Stratejik Öncelikli Araştırma Programı Grant XDB27040106 tarafından desteklendi.

1. Numune hazırlama
<ol><li>Kontrol ve stresle işlenmiş fideleri (1 g) alüminyum bir folyoda hasat edin ve numuneleri sıvı nitrojende flaşla dondurun. NOT: Daha yüksek protein konsantrasyonu genellikle iki haftalık fidelerden olgun bitkilerden daha fazla gözlenir. Bir gram fide, MS analizi için yeterli olan yaklaşık 10 mg protein lysate üretir. Tüm santrifüjleme adımları 1. </li>
	<li>Donmuş fideleri sıvı nitrojenle doldurulmuş bir harç ve pestle kullanarak ince bir toz haline getirin.</li>
	<li>1 mL lizis tamponu ekleyin ((100 mM Tris-HCl'de 6 M guanidin-HCl, pH 8.5) ile 10 mM Tris (2-karboksit)fosfin hidroklorür (TCEP), 40 mM 2-kloroasetamid (CAA), proteaz inhibitörü ve fosfataz inhibitörü kokteylleri) harcına karıştırın ve pestil yardımıyla karıştırın.</li>
	<li>Bitki lisatını 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 95 °C'de ısıtın.</li>
	<li>Tüpü 10 dakika boyunca buza yerleştirin. Tüpü 10 s buz üzerinde sonicate, 10 s için duraklatın ve üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>Tüpü 20 dakika ve aliquot 150 μL bitki lysate'yi 1,5 mL'lik bir tüpe santrifüj edin.</li>
	<li>Tüpe 600 μL% 100 metanol ekleyin. Girdap ve tüp aşağı dön.</li>
	<li>Tüpe 150 μL% 100 kloroform ekleyin. Girdap ve tüp aşağı dön.</li>
	<li>Tüpe 450 μL ddH2O ekleyin. Girdap ve santrifüj tüp 3 dakika.</li>
	<li>Üst sulu tabakayı atın. Tüpe 600 μL% 100 metanol ekleyin. Tüpü 3 dakika santrifüj edin ve ardından çözeltiyi atın.</li>
	<li>Protein peletlerini% 100 metanolden 600 μL ile yıkayın. Çözeltiyi atın ve protein peletini havayla kurutun.</li>
	<li>Protein peletlerini 600 μL sindirim tamponuna (12 mM sodyum deoksikolat (SDC)/12 mM sodyum lauroyl sarkolizat (SLS) 100 mM Tris-HCl, pH 8.5) olarak yeniden sunun. Süspansiyon homojenize olana kadar tüpü sonicate edin.</li>
	<li>Bir BCA kiti kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün ve sindirim tamponu ile konsantrasyonu 4 μg / μL'ye ayarlayın. 100 μL lysate (400 μg protein) yeni bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Tüpe 292 μL 50 mM trietilammonyum bikarbonat (TEAB) ve 8 μL Lys-C (2,5 Birim/mL) ekleyin. Tüpü 37 °C'de 3 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tüpe 8 μg tripsin ile 100 μL 50 mM TEAB ekleyin. Tüpü 37 °C'de 12 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tüpe 25 μL% 10 trifluoroasetik asit (TFA) ekleyin. Vorteks ve santrifüj tüpü 4 °C'de 20 dakika santrifüj edin.</li>
	<li>Süpernatantı tuzdan arındırma için koşullandırılmış bir tuzdan arındırma sütununa aktarın. Bir vakum santrifüj konsantratör kullanarak eluat kurutun. NOT: Reçineyi 1 mL metanol ve ardından %80 asetonitrilde (ACN) %0,1 TFA'nın 1 mL'si ile etkinleştirin. Organik çözücüyü %5 ACN'de en az 3 mL%0,1 TFA ile yıkayın. 1.16. adımda hazırlanan asitlenmiş peptit örneklerini kolona yükleyin ve ardından sütunu% 5 ACN'de% 0.1 TFA'nın en az 3 mL'si ile yıkayın. Yüksek tuz konsantrasyonlarına sahip numuneler için daha fazla yıkama gerekebilir. Fosfopenptitleri% 80 ACN'de% 0.1 TFA'nın 1 mL'si ile elute edin.</li>
</ol>2. Tandem Mass Tag (TMT) etiketleme
<ol><li>Kurutulmuş peptitleri 100 μL 200 mM 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES), pH 8.5'e yeniden tanımlayın.</li>
	<li>Her kanalın TMT reaktifini (0,8 mg) 40 μL susuz ACN'de çözün. TMT reaktif tüpünü 5 dakika boyunca girdap ve aşağı çevirin.</li>
	<li>40 μL TMT'yi numune tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. NOT: Bu deneyde, 126 ila 128 kanalı mannitol tedavisi olmayan bitkilerin üç biyolojik çoğaltılması ile, 129 ila 131 kanalı ise mannitol tedavisi ile bitkilerin üç biyolojik çoğaltılması ile etiketlenmiştir.</li>
	<li>8 μL% 5 hidroksilamin ekleyin ve 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>5 mL'lik bir tüpte 6 numuneyi karıştırın ve% 10 TFA'nın 14 μL'sini ekleyin.</li>
	<li>Tüpe %0,1 TFA'nın 3.876 μL'sini ekleyin. Girdap ve aşağı dön.</li>
	<li>Çözümü tuzdan arındırma için koşullandırılmış bir tuzdan arındırma sütununa aktarın. Buharlaştırıcı kullanarak elüat kurutun.</li>
</ol>3. IMAC aşama ucunun hazırlanması
<ol><li>Polipropilen frit diske nüfuz etmek için 16 G künt uçlu bir iğne kullanın. NOT: Kesiciyi diskin yüzeyine dik tutun ve diskin tamamen ekstrüzyona maruz olduğundan emin olmak için kesiciyi birkaç kez yuvarlayın. Diski saklamak için bir Petri kabına yerleştirin. İğneyi 200 μL pipet ucuna yerleştirin ve friti bir piston kullanarak ucuna itin.</li>
	<li>Ucun ucunu kaplamak için bir piston kullanarak friti hafifçe ucuna bastırın.<ol>
<li>Frit diski, daha iyi tekrarlanabilirlik sağlayan aynı basınca sahip uçlara yerleştirin. Aşama uçları üretiminin tekrarlanabilirliği, santrifüj adımlarının zamanlamasını ve teknik yinelemeler arasındaki tekrarlanabilirliği etkileyen sabit geri basınç için önemlidir.</li>
		<li>Aşama ipuçları koşullandırma adımı sırasında yüksek sırt basıncı gösteriyorsa, numuneleri yüklerken olası uç tıkanmasını önlemek için ipuçlarını atın. Disk çok fazla yerleştirilmiş olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ni-NTA spin sütununu ters çevirin ve 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.</li>
	<li>Ni-NTA boncuklarının fritini hafifçe bastırmak ve boncukları tüpe itmek için bir piston kullanın. NOT: Spin sütunundaki olası boncuk kaybını veya adsorpsiyonunu önlemek için friti hafifçe itmeye dikkat edin.</li>
</ol>4. Hp-RP sahne ucunun hazırlanması
<ol><li>C8 disk kullanarak IMAC aşama ucu için açıklandığı gibi Hp-RP sahne ucu hazırlayın. NOT: Diske büyük kuvvet uygulamayın, çünkü yoğun bir şekilde paketlenmiş bir frit ile sonuçlanabilir ve sahne ucunun geri basıncını artırabilir. Tüm santrifüjleme adımları, 4. </li>
	<li>100 μL%100 metanolde 1 mg C18 boncuk askıya alın ve boncuk çözeltisini ucundan geçirin.</li>
	<li>Sahne ucuna 20 μL tampon 8 (%80 ACN/%20 200 mMNH 4HCO2, pH 10.0) ekleyin ve tampon 8'i santrifüjleme ile uçtan geçirin.</li>
	<li>Sahne ucuna 20 μL Tampon A (200 mMNH 4HCO2)ekleyin ve A tamponunu santrifüjleme ile uçtan geçirin. NOT: Kullanım sırasında santrifüjü dengeleyin ve Hp-RP kademe ucunun tamamen kurumadığını sağlayın.</li>
</ol>5. Spin adaptörünün hazırlanması
<ol><li>1,5 mL'lik bir tüpün kapağının ortasındaki bir deliği delmek için keskin uçlu cımbız kullanın.</li>
	<li>IMAC kademe ucunu veya Hp-RP kademe ucunu spin adaptörünün deliğine takın. NOT: Sahne ucunun spin adaptörünün altına yakın olmadığından emin olun.</li>
</ol>6. IMAC aşama ucu kullanılarak fosfopenptid zenginleştirme
<ol><li>10 mg Ni-NTA boncuklarını 400 μL yükleme tamponu (%6 asetik asit (AA), pH 3.0) ile askıya alın ve tüm boncuk çözeltisini uç başına yükleyin. Çözeltiyi santrifüjleme ile ucundan geçirin. NOT: Tüm santrifüjleme adımları, adım 6.8'in yanı sıra 6.</li>
	<li>Nikel iyonlarını IMAC aşama ucundan çıkarmak ve çözeltiyi santrifüjleme ile uçtan geçirmek için 100 μL 50 mM etilenediaminetetraasetik asit (EDTA) yükleyin.</li>
	<li>Sahne ucuna 100 μL yükleme tamponu yükleyin ve çözeltiyi santrifüjleme ile uçtan geçirin.</li>
	<li>%6 AA'da 50 mM FeCl3'ün 100 μL'sini sahne ucuna yükleyin ve çözeltiyi santrifüjleme ile uçtan geçirin. Fe3+ iyonları IMAC sahne ucuna şelatlanacaktır.</li>
	<li>Sahne ucunu koşullandırmak için 100 μL yükleme tamponu yükleyin ve çözeltiyi santrifüjleme ile uçtan geçirin.</li>
	<li>2.7. adımda hazırlanan numune peptitleri ile 100 μL yükleme tamponunu sahne ucuna yükleyin ve çözeltiyi santrifüjleme ile uçtan geçirin. NOT: Numunenin akışını toplamak için spin adaptörü olarak yeni bir tüp alın ve akışı gelecekteki analizler için dondurucuda saklayın.</li>
	<li>Sahne ucuna 100 μL yıkama tamponu (%4,5 AA ve %25 ACN) yükleyin ve çözeltiyi santrifüjleme ile uçtan geçirin.</li>
	<li>yükleme arabelleği ile ikinci yıkamayı gerçekleştirin. Sahne ucuna 100 μL yükleme tamponu yükleyin ve çözeltiyi 3 dakika boyunca 1000 × g santrifüj kullanarak uçtan geçirin. NOT: Elution adımı sırasında fosfopenptit kaybını ortadan kaldırmak için yıkama tamponunun sahne ucuna tampon yükleyerek değiştirildiğinden emin olun. ACN konsantrasyonunun% 5'in altında olduğundan emin olmak için fosfopenptid elüasyonundan önce IMAC sahne ucunu aşındırın.</li>
	<li>Öndeki IMAC sahne ucunu bir makasla kırpın ve kesilmiş IMAC sahne ucunu Hp-RP ucunun içine yerleştirin. sahne uçlarının iki katmanının santrifüjün kapağına temas etmemesini sağlayın.</li>
</ol>7. Hp-RP C18 aşama ucu kullanılarak fosfopenptid fraksiyonasyonu
<ol><li>Kırpılmış IMAC sahne ucuna 100 μL elution tamponu (200 mM amonyum fosfat (NH4H2PO4)) ekleyin ve çözeltiyi santrifüjleme ile sahne uçlarının iki katmanından geçirin. NOT: Çözüm sahne ucuna geçmiyorsa, aşağı dönüş hızını artırın. Tüm santrifüjleme adımları, 7. Tüm Hp-RP arabellekleri Tablo 1'de listelenmiştir.</li>
	<li>Cımbız kullanarak IMAC kademe ucunu atın ve Hp-RP kademe ucuna 20 μL Tampon A ekleyin ve tamponu santrifüjleme ile uçtan geçirin. NOT: Tüm elution tamponun atılmadan önce IMAC aşama ucundan geçtiğinden emin olun.</li>
	<li>Kesir 1'i elüte etmek için 20 μL Tampon 1 ekleyin ve eluat'ı santrifüjleme ile yeni bir tüpte toplayın. Her kesiri yeni bir tüpte toplamak için işlemi Tamponlar 2, 3, 4, 5, 6, 7 ve 8 ile tekrarlayın. Vakum konsantratörü kullanarak her fraksiyonun son eluatını kurutun. NOT: Yeni kesirli tamponlar hazırlayın. Her fraksiyonun spin adaptörü olarak 8 yeni tüp alın. Her kesirdeki eluat'ı farklı bir spin adaptöründe toplayın. Fosfopenptitler temel koşullar altında stabil değildir, bu nedenle elüatları bir konsantratörle kurulayın veya hemen% 10 TFA ile asitlendirin.</li>
</ol>8. LC-MS/MS analizi ve veri analizi
<ol><li>%0,1 formik asit (FA) için 5 μL ekleyin ve numuneyi bir kütle spektrometresi ile analiz edin.</li>
	<li>Her kesir için %6-30 arabellek B (%80 ACN ve %0,1 SK) ile 90 dk gradyan çalıştırın.</li>
	<li>Yüksek çarpışma enerjisi ayrışması (HCD) kullanarak ilk 10 etiketli peptidi parçala. Fosforilasyon alanlarını tanımlamak için bir veritabanı aramasını tamamlayın.</li>
	<li>Ham dosyaları MaxQuant yazılımına yükleyin, denemeleri adlandırın ve kesirleri ve PTM'yi ayarlayın. NOT: MaxQuant yazılımının öğreticisi https://www.maxquant.org/ bulunabilir.</li>
	<li>LC-MS/MS çalıştırması türünde muhabir iyon MS2'yi ve izobarik etiketler olarak 6plex TMT'yi seçin. PIF işlevine göre filtreyi etkinleştirin ve en az PIF'i 0,75 olarak ayarlayın.</li>
	<li>Değişken değişiklikler paneline Asetil (Protein N-terim), Oksidasyon (M) ve Fosfo (STY) seçin. Sabit değişiklikler olarak Carbamidomethyl (C) öğesini seçin.</li>
	<li>Sindirim modunu belirli olarak ayarlayın, sindirim enzimi olarak Trypsin/P'yi ve iki kaçırılan bölünmeyi seçin.</li>
	<li>PSM yanlış bulma oranını (FDR) ve protein FDR'yi 0,01 olarak ayarlayın. Değiştirilmiş peptitler için minimum puanı 40 olarak ayarlayın.</li>
	<li>Arabidopsis thaliana veritabanını fasta dosyaları paneline ekleyin ve veritabanı aramasını çalıştırın.</li>
	<li>Arama yapılırken Fosfo (STY) sitelerinin txt dosyasını Perseus yazılımına yükleyin. NOT: Perseus yazılımının ayrıntılı öğreticilerini https://www.maxquant.org/perseus/.</li>
	<li>Ters fosforilasyon bölgelerini filtreleyin. Yerelleştirme olasılığını %75 keserek kireçlenmemiş fosforilasyon alanlarını filtreleyin.</li>
	<li>İstatistiksel analiz için fosforilasyon alanlarının yoğunluklarını kullanın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cellular+and+molecular+responses+to+high+salinity.">Plant cellular and molecular responses to high salinity.</a> Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).</li><li>Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+temperature+tolerance+in+plants:+Changes+at+the+protein+level.">Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level.</a> Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).</li><li>Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+networks+in+the+abscisic+acid+signaling+pathway.">Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway.</a> Enzymes. 35, 27-56 (2014).</li><li>Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+challenges+in+plant+phosphoproteomics.">Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics.</a> Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+proteome-wide+targets+of+protein+kinases+in+plant+stress+responses.">Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).</li><li>Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+decuple+mutant+reveals+the+importance+of+SnRK2+kinases+in+osmotic+stress+responses+in+vivo.">Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phosphoproteomics+identifies+SnRK2+protein+kinase+substrates+and+reveals+the+effectors+of+abscisic+acid+action.">Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).</li><li>Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+nine+sucrose+nonfermenting+1-related+protein+kinases+2+activated+by+hyperosmotic+and+saline+stresses+in+Arabidopsis+thaliana.">Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).</li><li>Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteomics+technologies+and+applications+in+plant+biology+research.">Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).</li><li>Hsu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+plant+phosphoproteomics+workflow+and+its+application+to+Tomato+signaling+in+response+to+cold+stress.">Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress.</a> Molecular &amp; Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).</li><li>Tsai, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+metal+affinity+chromatography+revisited:+pH/acid+control+toward+high+selectivity+in+phosphoproteomics.">Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics.</a> Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).</li><li>Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns.">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Molecular &amp; Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li><li>Ruprecht, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+and+reproducible+phosphopeptide+enrichment+using+iron+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography+(Fe-IMAC)+columns.">Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns.</a> Molecular &amp; Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).</li><li>Sugiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphopeptide+enrichment+by+aliphatic+hydroxy+acid-modified+metal+oxide+chromatography+for+nano-LC-MS/MS+in+proteomics+applications.">Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications.</a> Molecular &amp; Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).</li><li>Tsai, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+phosphoproteomic+enrichment+through+complementary+metal-directed+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.">Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+identification+of+phosphopeptides+from+putative+basophilic+kinase+substrates+using+Ti+(IV)+based+IMAC+enrichment.">Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment.</a> Molecular &amp; Cell Proteomics. 10 (10), (2011).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+high-pH+reverse+phase+stageTip+for+sensitive+small-scale+membrane+proteomic+profiling.">Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling.</a> Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+regulation+of+the+TOR+Kinase+and+ABA+receptor+balances+plant+growth+and+stress+response.">Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response.</a> Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RAF-SnRK2+kinase+cascade+mediates+early+osmotic+stress+signaling+in+higher+plants.">A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants.</a> Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).</li><li>Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+phosphoproteomics+reveals+in+vivo+insulin+signaling+dynamics.">High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).</li><li>Bekker-Jensen, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+shotgun+strategy+for+the+rapid+generation+of+comprehensive+human+proteomes.">An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes.</a> Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).</li><li>Possemato, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+phosphoproteomic+profiling+using+titanium+dioxide+and+immunoaffinity+enrichments+reveals+complementary+phosphorylation+events.">Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events.</a> Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).</li><li>Hogrebe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+common+quantification+strategies+for+large-scale+phosphoproteomics.">Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics.</a> Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).</li><li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteomics+of+Arabidopsis+Highly+ABA-Induced1+identifies+AT-Hook-Like10+phosphorylation+required+for+stress+growth+regulation.">Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).</li><li>Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=through+signaling+between+wheat+and+the+fungal+pathogen+Septoria+tritici+revealed+by+proteomics+and+phosphoproteomics.">through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics.</a> Molecular &amp; Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).</li><li>Tsai, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+Mass+Tag+labeling+facilitates+reversed-phase+liquid+chromatography-mass+spectrometry+analysis+of+hydrophilic+phosphopeptides.">Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides.</a> Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunun.

Bitki proteomunun dinamik aralığı ve karmaşıklığı ve fosfoproteom hala fosfoproteomik analizlerin derinliği için sınırlayıcı bir faktördür. 10.000 fosforilasyon bölgesi21 , 22'yitanımlamak için tek çalıştırmalı LC-MS / MS analizi yeteneğine rağmen, tüm bitki fosfoproteomunun kapsamı hala sınırlıdır. Bu nedenle, çevresel strese yanıt olarak tesis sinyal ağlarının küresel görünümünün profil oluşturmasında yüksek hassasi...

Yüksek tuzluluk, düşük sıcaklık ve kuraklık, bitki verimliliğini etkileyen önemli bir çevresel faktör olan ozmotik streslere neden olur1,2. Protein fosforilasyonu, osmotik strese santral tepkisinde sinyal algısına ve transdüksiyona aracılık eden çeviri sonrası en önemli modifikasyonlardan biridir3,4,5. SNF1 ile ilgili protein kinaz 2'ler (SnRK2s) ozmotik stres sinyalinde yer almaktadır6. SnRK2 ailesinin on üyesinden dokuzu ozmotik strese yanıt olarak önemli aktivasyon gösterir7,8. On SnRK2'nin tamamında mutasyona uğrayan snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple (snrk2-dec) mutant ozmotik strese karşı aşırı duyarlılık gösterdi. Snrk2-dec mutantında, inositol 1,4,5-trisfosfat (IP3),abscisic asit (ABA) biyosentezinin ozmotik stres kaynaklı birikimi ve gen ifadeleri güçlü bir şekilde azalır ve SnRK2'lerin ozmotik stres yanıtlarındaki hayati rolünü vurgular6. Bununla birlikte, SnRK2s kinazlarının bu biyolojik süreçleri nasıl düzenlediği hala belirsizdir. Osmotik strese yanıt olarak fosfoproteomik değişikliklerin profillenmesi, bu boşluğu kapatmanın ve bitkilerdeki ozmotik stresi tetikleyen savunma mekanizmalarını tanımlamanın etkili bir yoludur.
Kütle spektrometresi (MS), bitki fosfoproteom9'unharitalandırılması için güçlü bir tekniktir. Bununla birlikte, bitki fosfoproteomiklerinin karakterizasyonu, bitki proteomunun dinamik aralığı ve bitki lysate4'ünkarmaşıklığı nedeniyle bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, fototiretik pigmentler ve ikincil metabolitler gibi istenmeyen parazitleri ortadan tanıyan ve bitki fosfoproteomunun derin kapsamasını sağlayan evrensel bir bitki fosfoproteomik iş akışı geliştirdik10. MS analizi 11,12,13,14,15,16öncesinde fosfopenptidlerin zenginleştirilmesi için hareketsiz metal iyonbenzeşim kromatografisi (IMAC) ve metal oksit kromatografisi (MOC) gibi çeşitli fosfopenptid zenginleştirme yöntemleri geliştirilmiştir. Fosfopenptitlerle birlikte saflaştırıcı asidik fosfopenptitler fosfopenptid tespiti için başlıca girişimlerdir. Daha önce, fosfopenptitlerin bağlanmasını ortadan kaldırmak, ön fraksiyonasyon adım11'iatlayarak% 90'dan fazla zenginleştirme özgüllüğü elde etmek için IMAC yükleme tamponunun pH değerini ve organik asit konsantrasyonunu standartlaştırdık.
Fosfopenptid zenginleştirme ve fraksiyonasyonun çok adımlı sürecindeki numune kaybı fosfopenptid tanımlama hassasiyetini ve fosfoproteomik kapsamın derinliğini engeller. Durdur ve git ekstraksiyon ipuçları (aşama ipuçları), peptit fraksiyonasyonu ve temizliği için kromatografi ile birleştirilebilen ucun ucunu kaplamak için küçük diskler içeren pipet uçlarıdır17. Tüpler arasında numune aktarımı önlenerek kademe ucu işlemi sırasında numune kaybı en aza indirilebilir. Ga3+-IMAC ve Fe3+-IMAC'de, insan fosfoproteomunun derinliğini artıran tekil fosforilasyonlu peptitlerden düşük bol çoklu fosforillenmiş peptitleri ayırmak için aşama ipucunu başarıyla uyguladık15. Ek olarak, yüksek pH ters fazlı (Hp-RP) faz ucunun kullanımı, güçlü katyon değişimi (SCX) ve güçlü anion değişimi (SAX) kromatografisi18ile karşılaştırıldığında insan zarı proteomunun daha geniş kapsamını göstermiştir. Bu nedenle, IMAC ve Hp-RP kademe ucu tekniklerini entegre etmek, bitki fosfoproteom kapsamını basitlik, yüksek özgüllük ve yüksek verim ile artırabilir. Bu stratejinin Arabidopsis fidelerinden 20.000'den fazla fosforilasyon alanı tanımladığını ve bitki fosfoproteomunun gelişmiş bir derinliğini temsil ettiğini gösterdik19.
Burada, Arabidopsis'te fosfoproteomik profilleme için aşama ucu tabanlı fosfoproteomik bir protokol bildiriyoruz. Bu iş akışı, ozmotik strese yanıt olarak vahşi tip ve snrk2-dec mutant fidelerinin fosfoproteomik pertürbasyonunu incelemek için uygulanmıştır. Fosfoproteomik analiz, kinaz aktivasyonu ve erken ozmotik stres sinyali ile ilişkili fosforilasyon bölgelerini ortaya çıkardı. Vahşi tip ve snrk2-dec mutant fosfoproteome verilerinin karşılaştırmalı analizi, yüksek bitkilerde osmore stres sinyallerinde kilit rol oynayan Raf benzeri bir kinaz (RAF)-SnRK2 kinaz kaskadının keşfine yol açtı.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td>Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipet tip</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F1739311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-chloroacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5438080100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>338818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium phosphate monbasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt-ended needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>90516</td>
			<td>Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18-AQ beads</td>
			<td>Dr. Maisch</td>
			<td>ReproSil-Pur-C18-AQ 5 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C8 Empore disk</td>
			<td>3 M</td>
			<td>2214</td>
			<td>47 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22620444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CX1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td></td>
			<td>Perseus 1.6.2.1</td>
			<td>https://maxquant.net/perseus/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5330020050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frits</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>12131024</td>
			<td>Frits for SPE Cartridges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1153334000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (III) chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-orbitrap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Velos Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LTQ-Orbitrap Velos Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nano LC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Easy-nLC 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA spin column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>31014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plunger</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1122-01</td>
			<td>Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 &#956;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>search engine software</td>
			<td></td>
			<td>MaxQuant 1.5.4.1</td>
			<td>https://www.maxquant.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEP-PAK Cartridge 50 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT054960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SPD121P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT 6-plex</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium bicarbonate buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>91707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phosphoproteomic strategy for profiling osmotic stress signaling in arabidopsis

Protein fosforilasyonu, ozmotik durum altında enzim aktivitesinin ve gen ekspresyonunun düzenlenmesi için çok önemlidir. Kütle spektrometresi (MS) bazlı fosfoproteomik, bitki sinyali transdüksiyonunu inceleme şeklini dönüştürmüştür. Bununla birlikte, kapsama derinliğini elde etmek için çok sayıda başlangıç malzemesinin ve uzun ms ölçüm süresinin gerekliliği, bitkilerdeki küresel fosfoproteomik değişikliklerin yüksek verimli çalışması için sınırlayıcı faktör olmuştur. Bitki fosfoproteomiklerinin hassasiyetini ve verimini artırmak için, ozmotik strese yanıt olarak bitki fosforilasyon pertürbasyonunun hızlı ve kapsamlı analizi için Tandem Mass Tag (TMT) etiketlemesi ile birlikte dur ve git ekstraksiyonu (aşama) uç bazlı fosfoproteomik yaklaşım geliştirdik. Sahne ucu tekniğinin basitliğinden ve yüksek veriminden yararlanan tüm prosedür, fosfopenptid zenginleştirme, fraksiyonasyon ve numune temizleme adımlarını bitirmek için iki ipucu kullanarak yaklaşık bir saat sürer ve bu da yaklaşımın kullanımı kolay ve yüksek verimliliğini önerir. Bu yaklaşım sadece derinlemesine bir bitki fosfoproteomik analizi (> 11.000 fosfopenptid tanımlaması) sağlamaz, aynı zamanda bitişik kesirler arasındaki üstün ayırma verimliliğini (< % 5 örtüşme) gösterir. Ayrıca, vahşi tip ve snrk2 mutant bitkilerinin fosfoproteomik değişikliklerini ölçmek için TMT etiketlemesi kullanılarak çoklama sağlanmıştır. Bu yaklaşım, kara bitkilerinde erken ozmotik sinyalizasyonun anlaşılmasına ışık tutan ozmotik strese yanıt olarak Raf benzeri kinazların fosforilasyon olaylarını ortaya çıkarmak için başarıyla kullanılmıştır.

Bu iş akışının performansını göstermek için, 30 dakika boyunca mannitol tedavisi olan veya olmayan vahşi tip ve snrk2-dec mutant fidelerindeki fosfoproteomik değişiklikleri ölçmek için Hp-RP aşama ucu fraksiyonasyonu ile birlikte IMAC aşama ipucundan yararlandık. Her örnek biyolojik üç taraflı olarak gerçekleştirildi ve deneysel iş akışı Şekil 1'detemsil edildi. Her numunenin sindirilmiş peptitleri (400 μg) bir TMT-6plex kanalı ile etiketlendi, havuza...

Watch this Scientific Journal Video about Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis at JoVE.com

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Burada sunulan fosfoproteomik bir yaklaşımdır, yani arabidopsis fosfoproteomun yüksek verimli ve derin kapsamasını sağlayan dur ve git ekstraksiyon ucu bazlı fosfoproteomik. Bu yaklaşım Arabidopsis'te ozmotik stres sinyaline genel bakışı tanımlamaktedir.

Arabidopsis'te Osmotik Stres Sinyali Profili Çıkarmak için Fosfoproteomik Strateji

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

phosphoproteomic-strategy-for-profiling-osmotic-stress-signaling

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

5.1K Görüntüleme.  Carnegie Institute for Science. Burada sunulan fosfoproteomik bir yaklaşımdır, yani arabidopsis fosfoproteomun yüksek verimli ve derin kapsamasını sağlayan dur ve git ekstraksiyon ucu bazlı fosfoproteomik. Bu yaklaşım Arabidopsis'te ozmotik stres sinyaline genel bakışı tanımlamaktedir.

Video: Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a protocol is presented for the analysis of anionic and cationic metabolites in biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry (CE-MS). CE is well-suited for the analysis of highly polar and charged metabolites as compounds are separated on the basis of their charge-to-size ratio. A recently developed sheathless interfacing design, i.e., a porous tip interface, is used for coupling CE to electrospray ionization (ESI) MS. This interfacing approach allows the effective use of the intrinsically low-flow property of CE in combination with MS, resulting in nanomolar detection limits for a broad range of polar metabolite classes. The protocol presented here is based on employing a bare fused-silica capillary with a porous tip emitter at low-pH separation conditions for the analysis of a broad array of metabolite classes in biological samples. It is demonstrated that the same sheathless CE-MS method can be used for the profiling of cationic metabolites, including amino acids, nucleosides and small peptides, or anionic metabolites, including sugar phosphates, nucleotides and organic acids, by only switching the MS detection and separation voltage polarity. Highly information-rich metabolic profiles in various biological samples, such as urine, cerebrospinal fluid and extracts of the glioblastoma cell line, can be obtained by this protocol in less than 1 hr of CE-MS analysis.

Sheathless Capillary Electrophoresis&amp;#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

A protocol for metabolic profiling of biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry using a sheathless porous tip interface design is presented.

Biyolojik Numune metabolik profil için Sheathless Kapiler Elektroforez-Kütle Spektrometre

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Biyokimya

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from the oxidation of reduced compounds such as nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and flavin adenine dinucleotide (FADH2). The complete annotation of the Arabidopsis thaliana genome has established it as the most widely used plant model system, and thus the need to purify mitochondria from a variety of organs (leaf, root, or flower) is necessary to fully utilize the tools that are now available for Arabidopsis to study mitochondrial biology. Mitochondria are isolated by homogenization of the tissue using a variety of approaches, followed by a series of differential centrifugation steps producing a crude mitochondrial pellet that is further purified using continuous colloidal density gradient centrifugation. The colloidal density material is subsequently removed by multiple centrifugation steps. Starting from 100 g of fresh leaf tissue, 2 - 3 mg of mitochondria can be routinely obtained. Respiratory experiments on these mitochondria display typical rates of 100 - 250 nmol O2 min-1 mg total mitochondrial protein-1 (NADH-dependent rate) with the ability to use various substrates and inhibitors to determine which substrates are being oxidized and the capacity of the alternative and cytochrome terminal oxidases. This protocol describes an isolation method of mitochondria from Arabidopsis thaliana leaves using continuous colloidal density gradients and an efficient respiratory measurements of purified plant mitochondria.

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

As mitochondria are only a small percentage of the plant cell, they need to be purified for a range of studies. Mitochondria can be isolated from a variety of plant organs by homogenization, followed by differential and density gradient centrifugation to obtain a highly purified mitochondrial fraction.

Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) in eukaryotic cells. Precise identification of nitration sites on proteins is crucial for understanding the physiological and pathological processes related to protein nitration, such as inflammation, aging, and cancer. Since the nitrated proteins are of low abundance in cells even under induced conditions, no universal and efficient methods have been developed for the profiling and identification of protein nitration sites. Here we describe a protocol for nitropeptide enrichment by using a chemical reduction reaction and biotin labeling, followed by high resolution mass spectrometry. In our method, nitropeptide derivatives can be identified with high accuracy. Our method exhibits two advantages compared to the previously reported methods. First, dimethyl labeling is used to block the primary amine on nitropeptides, which can be used to generate quantitative results. Second, a disulfide bond containing NHS-biotin reagent is used for the enrichment, which can be further reduced and alkylated to enhance the detection signal on a mass spectrometer. This protocol has been successfully applied to the model peptide Angiotensin II in the current paper.

Proteomic profiling of tyrosine-nitrated proteins has been a challenging technique due to the low abundance of the 3-nitrotyrosine modification. Here we describe a novel approach for nitropeptide enrichment and profiling by using Angiotensin II as the model. This method can be extended for other in vitro or in vivo systems.

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. The binding of prokaryotic DnaG-like primases to DNA occurs at a specific trinucleotide recognition sequence. It is a pivotal step in the formation of Okazaki fragments. Conventional biochemical tools that are used to determine the DNA recognition sequence of DNA primase provide only limited information. Using a high-throughput microarray-based binding assay and consecutive biochemical analyses, it has been shown that 1) the specific binding context (flanking sequences of the recognition site) influences the binding strength of the DNA primase to its template DNA, and 2) stronger binding of primase to the DNA yields longer RNA primers, indicating higher processivity of the enzyme. This method combines PBM and primase activity assay and is designated as high-throughput primase profiling (HTPP), and it allows characterization of specific sequence recognition by DNA primase in unprecedented time and scalability.&#160;

Protein binding microarray (PBM) experiments combined with biochemical assays link the binding and catalytic properties of DNA primase, an enzyme that synthesizes RNA primers on template DNA. This method, designated as high-throughput primase profiling (HTPP), can be used to reveal DNA-binding patterns of a variety of enzymes.

Dna İlkase tarafından DNA Dizisi Tanıma Yüksek-Throughput Primase Profilleme kullanarak

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This publication presents a complete interaction proteomics workflow designed for identifying low abundance protein-protein interactions from the nucleus that could also be applied to other subcellular compartments. This workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, sample preparation, offline cleanup, single-shot label-free mass spectrometry, and downstream computational analysis and data visualization. Our protocol is optimized for detecting compartmentalized, low abundance interactions that are difficult to identify from whole cell lysates (e.g., transcription factor interactions in the nucleus) by immunoprecipitation of endogenous proteins from fractionated subcellular compartments. The sample preparation pipeline outlined here provides detailed instructions for the preparation of HeLa cell nuclear extract, immunoaffinity purification of endogenous bait protein, and quantitative mass spectrometry analysis. We also discuss methodological considerations for performing large-scale immunoprecipitation in mass spectrometry-based interaction profiling experiments and provide guidelines for evaluating data quality to distinguish true positive protein interactions from nonspecific interactions. This approach is demonstrated here by investigating the nuclear interactome of the CMGC kinase, DYRK1A, a low abundance protein kinase with poorly defined interactions within the nucleus.

Described is a proteomics workflow for identifying protein interaction partners from a nuclear subcellular fraction using immunoaffinity enrichment of a given protein of interest and label-free mass spectrometry. The workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, filter aided sample preparation, offline cleanup, mass spectrometry, and a downstream bioinformatics pipeline.

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and homeostasis of the vasculature system Therefore, deregulation in this signaling pathway results in severe vascular pathologies, such as pulmonary artery hypertension, hereditary hemorrhagic telangiectasia, and atherosclerosis. Endothelial cells (ECs), as the innermost layer of blood vessels, are constantly exposed to fluid shear stress (SS). Abnormal patterns of fluid SS have been shown to enhance TGF&#946;/BMP signaling, which, together with other stimuli, induce atherogenesis. In relation to this, atheroprone, low laminar SS was found to enhance TGF&#946;/BMP signaling while atheroprotective, high laminar SS, diminishes this signaling. To efficiently analyze the activation of these pathways, we designed a workflow to investigate the formation of transcription factor complexes under low laminar SS and high laminar SS conditions using a commercially available pneumatic pump system and proximity ligation assay (PLA).
Active TGF&#946;/BMP-signaling requires the formation of trimeric SMAD complexes consisting of two regulatory SMADs (R-SMAD); SMAD2/3 and SMAD1/5/8 for TGF&#946; and BMP signaling, respectively) with a common mediator SMAD (co-SMAD; SMAD4). Using PLA targeting different subunits of the trimeric SMAD-complex, i.e., either R-SMAD/co-SMAD or R-SMAD/R-SMAD, the formation of active SMAD transcription factor complexes can be measured quantitatively and spatially using fluorescence microscopy.
The usage of flow slides with 6 small parallel channels, that can be connected in series, allows for the investigation of the transcription factor complex formation and inclusion of necessary controls. 
The workflow explained here can be easily adapted for studies targeting the proximity of SMADs to other transcription factors or to transcription factor complexes other than SMADs, in different fluid SS conditions. The workflow presented here shows a quick and effective way to study the fluid SS induced TGF&#946;/BMP signaling in ECs, both quantitatively and spatially.

Here, we establish a protocol to simultaneously visualize and analyze multiple SMAD complexes using proximity ligation assay (PLA) in endothelial cells exposed to pathological and physiological fluid shear stress conditions.

Yakınlık-Ligasyon-Tahlil Kullanarak Farklı Sıvı Kesme Stres Koşulları Altında TGFβ/BMP/SMAD Sinyalinin Görselleştirilmesi ve Nicelleştirilmesi

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

Cryo-EM Yapısal Çalışmaları için Streptavidin Afinite Izgaralarının İmalatı

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, including sample denaturation and preferential orientations that can occur due to the air-water interface. Streptavidin affinity grids, however, are currently utilized by few cryo-EM labs because they are not commercially available and require a careful fabrication process. Two-dimensional streptavidin crystals are grown onto a biotinylated lipid monolayer that is applied directly to standard holey-carbon cryo-EM grids. The high-affinity interaction between streptavidin and biotin allows for the subsequent binding of biotinylated samples that are protected from the air-water interface during cryo-EM sample preparation. Additionally, these grids provide a strategy for concentrating samples available in limited quantities and purifying protein complexes of interest directly on the grids. Here, a step-by-step, optimized protocol is provided for the robust fabrication of streptavidin affinity grids for use in cryo-EM and negative-stain experiments. Additionally, a trouble-shooting guide is included for commonly experienced challenges to make the use of streptavidin affinity grids more accessible to the larger cryo-EM community.

Yazar Spotlight: Streptavidin-Biotin Yaklaşımı ile Cryo-EM Numune Hazırlamanın Geliştirilmesi

A step-by-step protocol for fabricating streptavidin affinity grids is provided for use in structural studies of challenging macromolecular samples by cryo-electron microscopy.

Kriyo-Elektron Mikroskobu Numune Hazırlama için Streptavidin-Afinite Izgarası İmalatı

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...