Bu protokol, belirli DNA dizilerine geçici olarak bağlanan ve rna astarlarının oluşumunu katalizler eden bir enzim olan primaz için protein-DNA bağlayıcı mikrodiziden büyük veri toplanmasını tanımlar. Bu video, mikrodizi teknolojisinin primaz dizisi tanıma sitelerinin yeniden tanımlanmasına nasıl yardımcı olabileceğini ve yüksek iş artışı yaklaşımının klasik biyokimyaya nasıl iltifat edebileceğini kapsayacak. Bu teknik iki yaklaşımı birleştirir: primaz DNA bağlayıcı mikrodizi ve primaz aktivitesi testi.
Mikrodizi, DNA dizilerine bağlanan primazın büyük verisini sağlarken, biyokimyasal satok DNA primazı ile RNA astar oluşumu hakkında bilgi sağlar. Test edilen enzimatik aktivite, mikrodizi deneyinin içgörüsünü ve doğasındaki düşük iş baçısından değişir. Bağlanmanın etkinliği, DNA dizisi seçimi ve enzimin aktivitesi arasındaki bağlantı incelenir.
Mikrodizi kullanarak dizi determinansının tanımlanması, mikrodizinin devasa verilerine dayanarak doğru sonuçlar çıkarmamızı sağlar. Bu yaklaşım şimdiye kadar transkripsiyon faktörlerinin DNA bağlayıcı dizilerini tanımlamak için kullanılmıştır. Transkripsiyon faktörleri DNA'ya sıkıca bağlanan statik proteinlerdir.
Prosedürü gösteren Stefan Iliç olacaktır. Bu yordamı başlatmak için, %0.01 Triton-X 100 içeren bir coplin kavanozuna yerleştirerek mikrodizi kaydırasını önceden ıslayın. Ve bir laboratuvar rotator üzerinde dönen, beş dakika için 125 rpm ekleyin.
Pipet plastik bir kutu içine engelleme çözeltisi. Sonra coplin kavanozundan mikrodizi slayt kaldırın. Slaydın DNA olmayan tarafını ve kenarlarını sürmek için ince bir silme kullanın.
Mikrodiziyi yavaşça plastik kutuya yerleştirin. Yavaş sallayarak bir saat oda sıcaklığında kuluçka. Bundan sonra, pbs% 0.01 Tween-20 ile slayt bir kez yıkayın.
125 rpm'de bir laboratuar rotatöründe beş dakika lığına. Tween-20'yi çıkarın ve 125 rpm'de pbs'de %0,01 Triton-X 100 ile kaydırağı iki dakika boyunca 125 rpm'de durulayın. Ardından slaytı hızlıbir şekilde PBS içeren bir kopya kavanozuna aktarın.
İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi PMB odasını monte edin. Slaytı belirlenen alana yerleştirin. Aşağı itmek ve solcırkullanın.
Silikon contayı üzerine yerleştirin, PBM haznesinin alt kısmıyla iyi hizalandığından emin olun. Sonra odayı kapatın ve çapraz vidaları sıkın. Pipet conta her kuyuiçine protein bağlayıcı karışımı.
Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yat. Başlamak için, pipet 0.05%Tween-20 PBS pbm odasına kısaca slayt yıkamak için. Bir vakum aspiratör kullanarak, DNA lekeleri dokunmamaya dikkat olmak odanın kuyularından çözelti kaldırın.
Bunu tekrarlayın, slaytı kısaca PBS ile yıkayın. Ve DNA lekeleri dokunmamaya dikkat ederken odanın kuyularından çözelti kaldırmak için vakum kullanın. Sonra, Alexa 488 Ekle SBM odasının her bir kuyuya, Onun Antikor'u konjuge.
30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka. Bundan sonra, kısaca her kuyuiçine PBS 0.05% Tween-20% birkaç damla ekleyerek PBM odası içinde slayt yıkayın. Ve vakum aspiratörü kullanarak çözeltiyi odanın kuyularından çıkartın, DNA noktalarına dokunmamaya dikkat edin.
PBM odasını sökün ve kaydırağı çıkarın. Slaytları PBS'de %0,05'lik Tween-20'de iki kez durulayın ve her bir durulama üç dakika sürer. Daha sonra, slaytları PBS'de iki kez durulayın ve her biri üçer dakika boyunca durulayın.
Ve bir keresinde üç dakika boyunca çift distile suda. Slaytları basınçlı hava ile kurulayın. Ve onları tarayıp hazır olana kadar koyu bir slayt kutusunda saklayın.
Hazır olduğunuzda, 495 nanometre uyarma ve 19 nanometre emisyon ile çiptarartiçin bir mikrodizi tarayıcı kullanın. Ve ortanca floresan yoğunluğunu toplayın. Bu çalışmada pi iş başı primase profilleme klasik araçlar kullanarak gözlemlemek imkansız değilse de zor olanlar da dahil olmak üzere primase bağlama siteleri, harita için kullanılır.
Daha da önemlisi, pi iş başı primase profilleme primase bağlama sitelerinin geleneksel anlayış revisiting sağlar. Özellikle pi iş başı primaz profilleme bilinen 5'GTC3'recognition dizilerine ek olarak bağlayıcı özellikleri ortaya çıkarır, bu da T7 DNA primazının fonksiyonel aktivitelerinde değişikliklere yol açar. Yani, dizileri iki grup tanımlanır.
Yanlarda TG içeren güçlü bağlayıcı DNA dizileri ve yanlarda AG içeren zayıf bağlayıcı DNA dizileri. 5'GTC3'in dizileri eksik olan DNA şablonlarına primas bağlanmadı. TG zengin yanları gibi özel özellikler içeren primase DNA tanıma siteleri, 10 kata kadar primase DNA bağlama artırmak.
Şaşırtıcı bir şekilde, yeni oluşan RNA'nın uzunluğunu da arttırırlar. Daha da önemlisi, yüksek iş yapma primaz profilleme bize gözlemlemek ve DNA şablonu dizisi ile ilgili olarak astar uzunluğu değişkenlik ölçmek için izin verir. Bu işlemi gerçekleştirirken yıkama adımları ince olmalıdır.
Ve arabellekler DNA'ya primase kaydetmiş bileşenler içermelidir. Ayrıca beyhude bağlama olaylarının eşiği biyokimyasal olarak belirlenir. Bu nedenle mikrodizinin analizi yetersizdir.
Yüzey plazma rezonansı ve jel kayması tahlilleri gibi yöntemler, DNA dizilerini seçmek için primazın bağlayıcı afinitesini belirleyebilir. Laboratuvarım, DNA polimeraz tarafından uzatılabilen üretken astarlar veren primase dizi belirleyicilerini tespit etmek için makine öğrenimi tahmin modellerini uygular. Büyük veri çağında, büyük verileri analiz etmek için istatistiksel yöntemlerin uygulanması, teknik kesinlikle daha iyi belirli DNA dizileri karakterize etmek ve primase aktivitesi için dizi tanıma bağlantı yardımcı olacaktır.
Radyasyon ile çalışan herkes iyonlaştırıcı radyasyon kullanımı ile ilgili düzenlemeler ve tehlikeleri ayrıntılı bir anlayışa sahip olmalıdır. Eğitimden geçilmeli ve güvenlik ekipmanları ile çalışmalıdır.
