Bu yöntem, kök hücre belirteçlerini in vivo edinen villi epitelin ayrıştırıcı organoid oluşturma kapasitesini doğrulayabilir. Villi koleksiyonu, organoid başlatma için gerektiğinde niş sinyalleri sağlayabilecek alttaki mezenkimlerin tamamen kaybını önleyen EDTA şelasyon yöntemi yerine kazıma yoluyla gerçekleştirilir. Bu yöntem, proliferatif ve farklılaştırılmış bölmelerin fiziksel olarak tanımlandığı ve farklılaşan hücrelerin kök hücre işaretleyicilerini in vivo olarak ifade ettiği epitel dokularda uygulanabilir.
Bu protokoldeki bazı faktörlerin ampirik olarak belirlenmesi gerekir, villinin toplanması için en uygun aşama ve villi kazınması için en uygun basınç da dahil olmak üzere, bu zaman ve uygulama alacaktır. Ardışık dört gün boyunca tamoksifen ve mısır yağının intraperitoneal enjeksiyonu ile mutant farelerde Smad4 nakavt ve beta-catenin fonksiyon mutasyonu kazancını teşvik edin. Fareyi ötenazi ettikten sonra, fare kürkünün periton boşluğuna girmesini önlemek için karnına% 70 etanol püskürtün.
Bağırsağı açığa çıkarmak için karın boşluğunu diseksiyon makası ile açın ve makas ve tostips kullanarak bağırsağı izole edin. Duodenumun proksimal yarısını parçalara ayırın, ardından ışık içeriğini temizlemek için duodenumu 10 mililitrelik bir şırıngamda beş mililitre buz soğuk PBS ile yıkayın. Duodenumu açılı bir makasla uzunlamasına açın ve duodenumu operatöre bakan duodenumun lümeni ile buz üzerinde 15 santimetrelik bir Petri kabına düz bir şekilde yerleştirin.
Kazımaya başlamadan önce, altı kuyulu bir doku kültürü plakasının kuyularından birine 70 mikrometre ağ süzgeci yerleştirin. Tüm kuyuları dört mililitre 1X PBS ile doldurun ve plakayı buza yerleştirin. Villiyi iki mikroskobik cam slayt kullanarak kazıyın, biri duodenumu aşağı tutmak ve diğeri kazımak için.
Duodenumun parlak tarafını villiyi çıkarmadan mukusu çıkarmak için yüzeysel olarak iki kez kazıyın, ardından vilinleri mahzenleri bağlamadan slaytlarda toplamak için duodenumu iki kez daha kazıyın. Villiyi altı kuyulu tabaktaki 70 mikrometre ağ süzgecine aktarmak için PBS içeren bir mililitre transfer pipeti kullanın. Her sıyrıktan sonra villi toplayın.
Gevşek mahzenleri çıkarmak için, 70 mikrometre süzgeçle toplanan villiyi, süzgeci kuyu başına dört mililitre buz soğuk PBS içeren altı kuyudaki bir dizi kuyudan aktararak yıkayın. Bir P1000 pipet kullanarak, villi süspansiyonu yaklaşık üç mililitre PBS'de 70 mikrometre süzgeçten buz üzerinde yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın. Villi süspansiyonun 50 mikroliter hacmini cam bir slayda aktarmak için %0,1 BSA kaplı künt uçlu P200 pipet ucu kullanın.
PBS süspansiyonunda villi konsantrasyonunun belirlenmesi ve bağlı mahzenlerin yokluğunu doğrulamak için 4X büyütme altındaki 50 mikroliter damlacıktaki villi sayısını sayın. Villiyi kaplamak için, Villi'yi 12,5 mikrolitre BME-R1 matrisinde kuyu başına altı villi kaplama yoğunluğu için bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için% 0,1 BSA kaplı P200 künt uçlu pipet ucu kullanın. Villi'den 200 kat G'de 4 santigrat derecede iki dakika döndürün.
Üstnatantı çıkarın ve artık PBS'yi çıkarmak için santrifüjü tekrarlayın. Laminer akış davlumbazında, villi peletini buz üzerinde çözülen gerekli miktarda soğuk BME-R1'de hafifçe yeniden depolayın. Bir P20 pipet kullanarak, 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış 96 kuyulu U tabanlı bir plakanın kuyusu başına BME-R1 matrisinde villinin 12,5 mikrolitresi.
BME-R1 matrisinin katılaşmasına izin vermek için plakayı 37 santigrat derecede bir doku kültürü inkübatöründe 15 dakika kuluçkaya yatırın. Her kuyuya, metin el yazmasında açıklandığı gibi eklenmiş 125 mikrolitre önceden ısıtılmış ENR ortamı ekleyin. Kaplamalı villiyi % 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir doku kültürü inkübatöründe kuluçkaya yatırın ve medyayı her gün değiştirin.
Organoidlerin iki günden önce göründüğü herhangi bir kuyuyı atın. Mahzenlerden çıkan organoidlerin görünüşünde, aynı fare bağırsaktan farklılaşmış villi epitel ile karşıtlık arasında fark vardır. Crypt türevi organoidler bir gecede iyi tanımlanmış kenarlıklara sahip küresel yapılar olarak görünür.
Villi'den başlatılan organoidlerin kinetik ve morfolojik görünümü incelendi, bu da ilk başta düzensiz şekilli göründü ve mikroskop altında görülebilmesi için iki ila beş gün sürdü. İki farklı villiden organoid inisiyonu gösterilir. Organoid oluşturma potansiyeline sahip villi, muhtemelen alttaki mezenkimlerin tutulması nedeniyle yoğun görünür.
Villalardan organoid inisiyonu, villilerden birinden ikinci günde belirgindir. Diğer villalardayken, organoid dördüncü günde ortaya çıkar. Villi'yi toplarken ve elde eden organoidleri yetiştirirken mahzen kirlenmesini önlemek için uygun adımları atmak çok önemlidir.
Bu prosedürün ardından aynı mutantın mahzenlerinden ve villilerinden çıkan organoidler arasındaki fenotipik farklılıklar gözlendi, bu nedenle ikisi arasındaki moleküler farklılıkları aramak için daha fazla deney yapılabilirdi. Bu protokol, endojen mahzenlerden kaynaklanan organoidler ile de-differentiasyondan kaynaklanan ektopik mahzenler arasındaki farkları incelemek için kullanılabilir, böylece de-differentiation etkileri ele alınabilebilir.
