Astar geliştirme ve testlerinde yardımcı olan Alvi Wadud ve Trudi Frost'a teşekkür ederiz. Bu çalışmada bildirilen tahlil tasarımı için fon Savunma Bakanlığı Stratejik Çevre Araştırma ve Geliştirme Programı (RC19-1156) tarafından sağlanmıştır. Ticari, ürün veya firma adlarının herhangi bir şekilde kullanılması yalnızca açıklayıcı amaçlar içindir ve ABD Hükümeti tarafından onay anlamına gelmez. Bu çalışma sırasında oluşturulan veriler USGS veri yayınlama https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5 olarak mevcuttur.

<ol>
	<li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+real-time+polymerase+chain+reaction.">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).</li><li>Higuchi, R. D., Walsh, P. S., Griffith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+amplification+and+detection+of+specific+DNA+sequences.">Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.</a> Biotechnology. 10, 5 (1992).</li><li>Mauvisseau, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+accuracy,+repeatability+and+detection+probability+in+the+reliability+of+species-specific+eDNA+based+approaches.">Influence of accuracy, repeatability and detection probability in the reliability of species-specific eDNA based approaches.</a> Scientific Reports. 9 (1), 580 (2019).</li><li>Hernandez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=60+specific+eDNA+qPCR+assays+to+detect+invasive,+threatened,+and+exploited+freshwater+vertebrates+and+invertebrates+in+Eastern+Canada.">60 specific eDNA qPCR assays to detect invasive, threatened, and exploited freshwater vertebrates and invertebrates in Eastern Canada.</a> Environmental DNA. , (2020).</li><li>Klymus, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+the+limits+of+detection+and+quantification+for+environmental+DNA+assays.">Reporting the limits of detection and quantification for environmental DNA assays.</a> Environmental DNA. , (2019).</li><li>Thalinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+validation+scale+to+determine+the+readiness+of+environmental+DNA+assays+for+routine+species+monitoring.">A validation scale to determine the readiness of environmental DNA assays for routine species monitoring.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Helbing, C. C., Hobbs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+DNA+Standardization+Needs+for+Fish+and+Wildlife+Population+Assessments+and+Monitoring.">Environmental DNA Standardization Needs for Fish and Wildlife Population Assessments and Monitoring.</a> CSA Group. , (2019).</li><li>Sepulveda, A. J., Nelson, N. M., Jerde, C. L., Luikart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Environmental+DNA+Methods+Ready+for+Aquatic+Invasive+Species+Management.">Are Environmental DNA Methods Ready for Aquatic Invasive Species Management.</a> Trends in Ecology &amp; Evolution. , (2020).</li><li>Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, M. W., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+is+a+PCR+efficiency+estimate:+Recommendations+for+precise+and+robust+qPCR+efficiency+assessments.">How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 3, 9-16 (2015).</li><li>Wilcox, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+detection+of+rare+species+using+environmental+DNA:+the+importance+of+primer+specificity.">Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity.</a> PLoS One. 8 (3), 59520 (2013).</li><li>Prediger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+design+primers+and+probes+for+PCR+and+qPCR.">How to design primers and probes for PCR and qPCR.</a> IDT. , (2020).</li><li>Thornton, B., Basu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+(qPCR)+primer+design+using+free+online+software.">Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 39, 145-154 (2011).</li><li>Owczarzy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDT+SciTools:+a+suite+for+analysis+and+design+of+nucleic+acid+oligomers.">IDT SciTools: a suite for analysis and design of nucleic acid oligomers.</a> Nucleic Acids Research. 36, 163-169 (2008).</li><li>Kibbe, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OligoCalc:+an+online+oligonucleotide+properties+calculator.">OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator.</a> Nucleic Acids Research. 35, 43-46 (2007).</li><li>Taylor, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ultimate+qPCR+Experiment:+Producing+Publication+Quality,+Reproducible+Data+the+First+Time.">The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time.</a> Trends in Biotechnology. 37 (7), 761-774 (2019).</li><li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (134), 11 (2012).</li><li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Local+Alignment+Search+Tool.">Basic Local Alignment Search Tool.</a> Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Bio-Rad. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bio-Rad Vol. 5279. , (2020).</li><li>Bio-Rad. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bio-Rad Vol. 6894. , (2020).</li><li>Eurogentec. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Eurogentec. Vol. 0708-V2. , (2020).</li><li>Bustin, S., Huggett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qPCR+primer+design+revisited.">qPCR primer design revisited.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).</li><li>Hoorfar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+in+design+of+internal+amplification+controls+for+diagnostic+PCR+assays.">Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays.</a> Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).</li><li>Goldberg, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+considerations+for+the+application+of+environmental+DNA+methods+to+detect+aquatic+species.">Critical considerations for the application of environmental DNA methods to detect aquatic species.</a> Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1299-1307 (2016).</li><li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+DNA+(eDNA)+Assays+for+Invasive+Populations+of+Black+Carp+in+North+America.">Environmental DNA (eDNA) Assays for Invasive Populations of Black Carp in North America.</a> Transactions of the American Fisheries Society. 148 (6), 1043-1055 (2019).</li><li>Mosher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+molecular+detection+studies+require+clear+communication+among+diverse+research+partners.">Successful molecular detection studies require clear communication among diverse research partners.</a> Frontiers in Ecology and the Environment. 18 (1), 43-51 (2019).</li><li>Kwonga, S., Srivathsana, A., Meier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+on+DNA+barcoding:+low+species+coverage+and+numerous+unidentified+sequences.">An update on DNA barcoding: low species coverage and numerous unidentified sequences.</a> Cladistics. 28, 6 (2012).</li><li>Rees, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REVIEW:+The+detection+of+aquatic+animal+species+using+environmental+DNA+-+a+review+of+eDNA+as+a+survey+tool+in+ecology.">REVIEW: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology.</a> Journal of Applied Ecology. 51 (5), 1450-1459 (2014).</li><li>Evans, N. T., Lamberti, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freshwater+fisheries+assessment+using+environmental+DNA:+A+primer+on+the+method,+its+potential,+and+shortcomings+as+a+conservation+tool.">Freshwater fisheries assessment using environmental DNA: A primer on the method, its potential, and shortcomings as a conservation tool.</a> Fisheries Research. 197, 60-66 (2018).</li><li>Forootan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+limit+of+detection+and+limit+of+quantification+in+quantitative+real-time+PCR+(qPCR).">Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR).</a> Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).</li><li>Sengupta, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+DNA+for+improved+detection+and+environmental+surveillance+of+schistosomiasis.">Environmental DNA for improved detection and environmental surveillance of schistosomiasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 8931-8940 (2019).</li><li>Klymus, K. E., Richter, C. A., Chapman, D. C., Paukert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+eDNA+shedding+rates+from+invasive+bighead+carp+Hypophthalmichthys+nobilis+and+silver+carp+Hypophthalmichthys+molitrix.">Quantification of eDNA shedding rates from invasive bighead carp Hypophthalmichthys nobilis and silver carp Hypophthalmichthys molitrix.</a> Biological Conservation. 183, 77-84 (2015).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunun. Fon sponsorlarının çalışmanın tasarımında hiçbir rolü yoktu; verilerin toplanmasında, analizlerinde veya yorumlanmasında; yazının yazımında; veya sonuçların yayımlanması kararında.

Her çalışmada olduğu gibi, ele alınacak soruyu tanımlamak ilk adımdır ve eDNA testinin tasarımı çalışmanın kapsamına bağlıdır.26. Örneğin, araştırmanın veya anketin amacı bir veya birkaç türü tespit etmekse, hedeflenen bir sonda tabanlı test en iyisidir. Bununla birlikte, amaç türlerin daha büyük bir paketini veya montajını değerlendirmekse, yüksek verimli sıralama metabarkodlama tahlilleri daha uygundur. Hangi yaklaşımın benimseyeceği belirlendikten sonra, tahlil tasarımı, test ve optimizasyon içeren bir pilot çalışma önerilir.24. Tahlil tasarımı, Şekil 1. Bu liste, bir tahlilin özgüllük ve uygulanabileceği coğrafi aralık açısından ne kadar iyi performans gösterdiğini anlamanın temelini oluşturacaktır.6,10. Testin belirli bir coğrafi alan için tasarlanması, tasarımcının o bölgedeki diğer türlere karşı çapraz reaktivite için bir testi daha iyi test etmesini ve bunun bir testin hedef türün oluşabileceği diğer alanlara genişletilmesindeki sınırlamaların farkında olmasını sağlamak teşvik edilir.24. Liste tamamlandıktan sonra, diziler genel genetik veritabanlarından indirilebilir. Bu veritabanları eksik olduğundan27, tahlil tasarımında kullanılacak dizilerin yerel referans veritabanını tamamlamak için listedeki mümkün olduğunca çok türü evde sıralamalıdır. Birlikte meydana gelen yakından ilişkili türlere öncelik vermek, çünkü bunlar en olası hedef olmayanlardır. Hedef türle aynı cins veya aile içindeki tüm türlere odaklanmak başlamak için iyi bir yerdir. Yakından ilişkili türlerle yapılan karşılaştırmalar, hedef türlere özgü sıra bölgelerini belirlemeye yardımcı olacaktır. Bu, tahlillerin diğer sistemlerde veya konumlarda nasıl performans gösterebileceğini bildirmeye yardımcı olabilir. Mitokondriyal bölgeler tahlil gelişimi için olağan seçimdir, çünkü yaşam projelerinin barkodunda kullanılan mitokondriyal genlerde daha çeşitli türlerden daha fazla dizi bilgisi mevcuttur ve mitokondriyal DNA, kopyalarda / hücrede nükleer DNA'dan çok daha fazla konsantrasyonda bulunur.24,28,29. Dizi kapsamı genetik depo veritabanlarındaki takson arasında değiştiği için daha fazla test gelişimi için birden fazla gen bölgesi değerlendirilmelidir. Bu yerel başvuru dizileri veritabanı oluşturulduktan sonra, astar/prob tahlillerini tasarlamak için hizalanmış sıra verilerinin ve bilgisayar yazılım programlarının manuel görselleştirilmesinin bir kombinasyonu kullanılır. Hangi tahlillerin test edilmesi gerektiğini belirlemek için kesinlikle yazılıma güvenmemek gerekir. Bir PCR'de nasıl davranabileceklerini daha iyi anlamak için astarların ve probların hedeflere ve hedef olmayanlara oturduğu hizalamalarda görsel olarak doğrulamak önemlidir. Son olarak tahlil tarama ve optimizasyon üç seviye içerir (siliko, in vitro ve in situ)6,7,24,25. Siliko tasarımında ve testlerinde başarı şansı yüksek kısa bir test listesi üretmek önemlidir, ancak ampirik (in vitro) test, tahlilleri en iyi gerçek performansla seçmek için çok önemlidir. In vitro optimizasyonu ve tahlillerin test edilmesi, reaksiyon verimliliğinin ölçülmesi ve testin hassasiyetinin ve özgüllüğünün tanımlanmasını içerir. Algılama ve niceleme sınırları, tahlil geliştirmede sıklıkla göz ardı edilen ancak veri yorumlama için önemli olan iki parametredir. Bir test için standart eğrilerin birden fazla çoğaltmasını çalıştırarak, LOD ve LOQ kolayca ölçülebilir1,5,30. Çok az çalışma, testin LOD veya LOQ'su ile ilgili sonuçları tartışır, ancak Sengupta ve arkadaşları (2019), sonuçlarının daha net anlaşılması için testlerinin LOD ve LOQ'larını veri yorumlama ve grafiklerine dahil eder.31. dahili pozitif kontroller de tasarlanan teste çoklayıcı olmalıdır. Örneklerde PCR inhibisyonu testi yapılmadan, yanlış negatifler oluşabilir24,32. PCR inhibisyon testi için en kolay yöntem olarak hedef test ile çok yönlü bir IPC testinin kullanılmasını öneriyoruz23. Son olarak, saha ve laboratuvardan toplanan numunelerden yapılan testin yerinde test edilmesi, çevresel örneklerde hedef amplifikasyonun gerçekleşmesini sağlamak için gereklidir.24.
Türlere özgü, prob tabanlı qPCR testlerinin eDNA örnekleriyle kullanımı için sınırlamalar mevcuttur. Örneğin, test için birden fazla tahlil tasarımı sıra kullanılabilirliği ile sınırlı olabilir ve test performansının yönleri üzerinde uzlaşma gerekebilir. Bu seçimler çalışmanın hedeflerine göre yönlendirilmeli ve sonuçlarla birlikte bildirilmelidir26. Örneğin, amaç nadir bir türün tespiti ise ve birkaç pozitif bekleniyorsa, tüm algılamalar sıralama ile doğrulanacaksa kusurlu özgüllüğe sahip bir tahlil (yani hedef olmayan türlerin amplifikasyonu) kullanılabilir. Amaç bir türün coğrafi aralığını izlemekse ve eDNA konsantrasyon verilerine gerek yoksa, kusurlu verimliliğe sahip bir test kullanılabilir ve veriler yalnızca yüzde tespiti olarak bildirilebilir. Ayrıca, tüm potansiyel spesifikler laboratuvarda test edilmediği sürece, ki bu nadiren mümkündür, bir testin gerçek özgüllüğünü kesin olarak bilemez. Örneğin, test Clinch Nehri'ndeki birkaç tatlı su midye türüne karşı tasarlanmış ve test edilmiştir. Bu testi farklı bir nehir sisteminde kullanmak için, yeni yerdeki bir tür paketine karşı test etmemiz gerekir. Test gelişimi sırasında test olmayan türler veya popülasyon içindeki genetik varyasyon da özgüllüğü etkileyebilir. Son olarak, bir tahlil yüksek teknik performansa sahip olduğu doğrulanmış olsa bile; alanda çalışırken koşullar değişir. Su akışı, pH ve hayvan davranışı gibi testle ilgili olmayan koşullar, farklı eDNA toplama ve çıkarma protokollerinin kullanılabileceği gibi eDNA algılanabilirliğini değiştirebilir. Optimize edilmiş ve iyi tanımlanmış tahlillerin kullanılması, bu tür parametrelerin eDNA algılaması üzerindeki etkisinin anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.
eDNA alanı, keşif analizi aşamasının ötesinde, yöntem ve tekniklerin standardizasyonunu artırmaya kadar olgunlaşmaktır. Bu gelişmeler eDNA tekniklerini, yeteneklerini ve sınırlamalarını anlamamızı geliştirecektir. Yukarıda özetlediğimiz optimizasyon süreci, bir analizin hassasiyetini, özgüllüğünü ve tekrarlanabilirliğini geliştirir. Bu iyileştirmenin ve eDNA yöntemlerinin standardizasyonunun nihai amacı, araştırmacıların eDNA verilerine dayalı çıkarımlar yapma yeteneklerini geliştirmek ve sonuçlara olan son kullanıcı ve bahis sahibi güvenini artırmaktır.

Araştırmacılar ve yöneticiler, tür tespiti için çevresel DNA testlerinin kullanımıyla giderek daha fazla ilgilenmeye başladı. Otuz yıldır, nicel veya gerçek zamanlı PCR (qPCR / rtPCR) nükleik asitlerin diziye özgü tespiti ve nicelleştirilmesi için çok sayıda alanda 1,2. EDNA araştırmasının nispeten yeni alanında, bu tahlillerin, eDNA örneğinin hacmi veya ağırlığı başına hedef DNA kopyalarının ölçülmesi için standart bir eğri ile kullanılması artık rutin bir uygulama haline gelmiştir. Mitokondriyal DNA dizileri genellikle eDNA tahlillerinde hedeflenir, çünkü mitokondriyal genom hücre başına binlerce kopyada bulunur, ancak nükleer DNA veya RNA dizileri için tahliller de mümkündür. eDNA örnekleri için yayınlanan testlerin performansta her zaman eşit olmadığını anlamak çok önemlidir. Bir testin yalnızca bir hedef türün DNA'sını (yani özgüllüğü) tespit etmedeki güvenilirliği ve düşük miktarda hedef DNA'nın (yani hassasiyet) tespit edilmesi, testin nasıl tasarlandığı, seçildiği, optimize edildiği ve test edildiği konusundaki farklılıklar nedeniyle önemli ölçüde değişebilir. Test performansının nicel önlemlerinin rapor edildiği daha önce büyük ölçüde göz ardı edilmiştir, ancak son zamanlarda tahlil gelişiminde şeffaflığı artırmaya yönelik standartlar ortaya çıkıyor 3 ,4,5,6,7,8.
EDNA anket sonuçlarının eDNA anket sonuçlarının incelenmesi ve yorumlanmasında tahlil performans yardımcılarının optimizasyonu ve raporlanması. Hedef olmayan tür DNA'sı ile çapraz reaksiyon gösteren tahliller yanlış pozitif tespitlere yol açabilirken, hassasiyeti zayıf olan tahliller örnekte mevcut olsa bile hedef tür DNA'sını tespit edemeyebilir (yanlış negatifler). Test hassasiyeti ve seçicilik anlayışı, nadir türleri tespit etmek için gereken örnekleme çabasını bilgilendirmeye yardımcı olacaktır. eDNA'da birçok doğal varyasyon kaynağı olduğundan, çalışmalar kontrol edilebilir varyasyon kaynaklarını mümkün olduğunca sınırlamalıdır, eDNA testini tamamen optimize etmek ve karakterize etmek de dahil olmak üzere3.
Bir tahlilin özgüllüğünü veya hassasiyetini doğrudan etkileyen koşullar, tahlilin performansını değiştirecektir. Bu, farklı laboratuvar koşullarında (örneğin, farklı reaktifler, kullanıcılar, makineler vb.) oluşabilir. Bu nedenle, yeni koşullar altında bir tahlil uygulanırken bu protokol yeniden ele alınmalıdır. Literatürde iyi karakterize edilen tahliller bile, yeni bir laboratuvar tarafından benimsendiğinde veya farklı reaktifler (örneğin, ana karışım çözeltisi)5,9. Test farklı bir coğrafi bölgeye uygulandığında test özgüllüğü değişebilir, çünkü test, testin test edilmemiş olduğu hedef olmayan türleri içerebilecek yeni bir biyotik topluluktan alınan örneklere uygulanmaktadır ve hedef türlerde genetik varyasyon meydana gelebilir. Yine, test yeni bir konumda kullanıldığında yeniden değerlendirilmelidir. Saha koşulları laboratuvar koşullarından farklıdır, çünkü sahada PCR inhibitörlerinin numunelerde bulunma olasılığı daha yüksektir. PCR inhibitörleri amplifikasyon reaksiyonu doğrudan etkiler ve böylece tahlil performansını etkiler. Bu nedenle, bir eDNA tahlili geliştirirken dahili bir pozitif kontrol gereklidir.
Son olarak, alandaki çevresel koşullar, hedef türün DNA moleküllerini ve DNA bozulması, taşınması ve tutulması yoluyla yakalanmasını etkileyebilir. Ayrıca, DNA toplama ve çıkarma için farklı protokoller, DNA'yı tutma verimliliklerine ve yeteneklerine göre değişir. Bununla birlikte, bu süreçlerin eDNA'nın tespit edilebilirliğini etkilediğini, ancak moleküler bir tahlil performansını etkilemediğini belirtmek önemlidir. Bu nedenle, alan örneklerinde hedef türlerden DNA'nın tespit edilebilirliği, hem qPCR testinin teknik performansının hem de saha koşullarının ve toplama, depolama ve çıkarma protokollerinin bir işlevidir. İyi karakterize edilmiş ve yüksek performanslı bir tahlil kullanırken, kullanıcılar tahlil yeteneklerinden emin hissedebilirler; araştırmacıların artık eDNA algılamasını etkileyen dış tahlil faktörlerini (yani çevresel değişkenler, yakalama veya çıkarma protokollerindeki farklılıklar) anlamaya odaklanmalarını sağlar.
Burada özellikle titiz tasarım ve optimizasyon yoluyla teknik performansı test etmeye odaklanıyoruz. Protokolü, ABD'nin Clinch Nehri'nde örnek alınan sudan bir tatlı su midyesi olan mucket'in(Actinonaias ligamentina)tespiti için geliştirilen sonda bazlı bir tahlil kullanarak gösteriyoruz. Son zamanlarda Thalinger ve arkadaşları (2020), hedeflenen eDNA testlerinin doğrulanması için yönergeler sundu. Protokolümüzü takip eden tahlil tasarımı Thalinger ve arkadaşlarının seviye 4'üne bir test artı seviye 56'yadoğru ek bir adım getirecektir. Bu noktada bir tahlil teknik performansı optimize edilecek, laboratuvar ve saha uygulamalarında düzenli kullanıma hazır hale gelecektir. Tahlillerin laboratuvar, mezokozm ve saha deneylerinde daha fazla kullanılması, eDNA tespiti ve tespit edilebilirliği etkileyen faktörler, seviye 5 doğrulama6için son adımlar ile ilgili soruları ele alabilir.

<table><tbody><tr><td>96 Place Reversible Racks with Covers</td><td>Globe Scientific</td><td>456355AST</td><td></td></tr><tr><td>Clean gloves (ie. latex, nitrile, etc.)</td><td>Kimberly-Clark</td><td>43431, 55090</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>2681332</td><td></td></tr><tr><td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td><td>Bio-Rad</td><td>#HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>IPC forward and reverse primers</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>custom product</td></tr><tr><td>IPC PrimeTime qPCR Probes</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>custom product</td></tr><tr><td>IPC Ultramer DNA Oligo synthetic template</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>custom product</td></tr><tr><td>Labnet MPS 1000 Compact Mini Plate Spinner Centrifuge for PCR Plates</td><td>Labnet</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge machine</td><td>Various</td><td>-</td><td>Any microcentrifuge machine that hold 1.5mL and 2.0mL tubes is typically okay.</td></tr><tr><td>Microseal &#039;B&#039; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips GP LTS 1000 &amp;micro;L F 768A/8</td><td>Rainin</td><td>30389272</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips GP LTS 20 &amp;micro;L F 960A/10</td><td>Rainin</td><td>30389274</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips GP LTS 200 &amp;micro;L F 960A/10</td><td>Rainin</td><td>30389276</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Rainin</td><td>Various</td><td>Depending on lab preference, manual or electronic pipettes can be used at various maximum volumes.</td></tr><tr><td>TaqMan Environmental Master Mix 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4396838</td><td></td></tr><tr><td>Target forward and reverse primers</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>custom product</td></tr><tr><td>Target PrimeTime qPCR Probes</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>custom product</td></tr><tr><td>Target synthetic gBlock gene fragment</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>custom product. used for qPCR standard dilution series</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>AM9849</td><td></td></tr><tr><td>VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXER</td><td>Fisher Scientific</td><td>50728002</td><td></td></tr></tbody></table>

development and testing of species-specific quantitative pcr assays for environmental dna applications

Balıkçılık ve doğal hayatı koruma yönetimine yardımcı olmak için tür varlığını tespit etmek ve izlemek için yeni, invaziv olmayan yöntemler geliştirilmektedir. Makrobiyotayı tespit etmek için çevresel DNA (eDNA) örneklerinin kullanılması, hızla popüler hale gelen ve ulusal yönetim programlarında uygulanan bu tür yöntemlerden biridir. Burada prob bazlı nicel PCR (qPCR) uygulamaları için türlere özgü hedefli tahlillerin geliştirilmesine odaklanıyoruz. Prob tabanlı qPCR kullanmak, tek başına astarlarla mümkün olandan daha fazla özgüllük sunar. Ayrıca, bir numunedeki DNA miktarını ölçme yeteneği, eDNA'nın ekolojisini ve alandaki eDNA algılama kalıplarının yorumlanmasını anlamamızda yararlı olabilir. Hedef türlerin çevresel bir numuneden tespit edilmesi hassasiyetini ve özgüllüğünü sağlamak için bu tahlillerin geliştirilmesinde ve testinde dikkatli bir değerlendirmeye ihtiyaç vardır. Bu protokolde, hedef bir türün tespiti için prob tabanlı tahlillerin tasarlanması ve test edilmesi için gereken adımları tespit edeceğiz; sıra veritabanlarının oluşturulması, tahlil tasarımı, tahlil seçimi ve optimizasyonu, test tahlil performansı ve alan doğrulaması dahil. Bu adımların ardından, güvenle kullanılabilecek verimli, hassas ve spesifik bir test elde edilmesine yardımcı olacaktır. Bu süreci, ABD'nin Clinch Nehri'nde bulunan tatlı su midyesi türü olan mucket popülasyonları (Actinonaias ligamentina) popülasyonlarıiçin tasarlanmış tahlillerimizle gösteriyoruz.

Watch this Scientific Journal Video about Development and Testing of Species-specific Quantitative PCR Assays for Environmental DNA Applications at JoVE.com

Development and Testing of Species-specific Quantitative PCR Assays for Environmental DNA Applications

Çevresel DNA tahlilleri, alan verilerinin toplanmasına başlamadan önce titiz bir tasarım, test, optimizasyon ve doğrulama gerektirir. Burada, çevresel örneklerden hedef tür DNA'sının tespiti ve nicelleştirilmesi için türe özgü, prob tabanlı bir qPCR testi tasarlamanın her adımında kullanıcıları götürecek bir protokol sunuyoruz.

ÇevreSEL DNA Uygulamaları için Türlere Özgü Nicel PCR Testlerinin Geliştirilmesi ve Testi

New, non-invasive methods for detecting and monitoring species presence are being developed to aid in fisheries and wildlife conservation management. The ...

development-testing-species-specific-quantitative-pcr-assays-for

Research

JoVE Journal

Environment

12.7K Görüntüleme.  U.S. Geological Survey. Çevresel DNA tahlilleri, alan verilerinin toplanmasına başlamadan önce titiz bir tasarım, test, optimizasyon ve doğrulama gerektirir. Burada, çevresel örneklerden hedef tür DNA'sının tespiti ve nicelleştirilmesi için türe özgü, prob tabanlı bir qPCR testi tasarlamanın her adımında kullanıcıları götürecek bir protokol sunuyoruz.

Video: Development and Testing of Species-specific Quantitative PCR Assays for Environmental DNA Applications

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

Eşzamanlı Niceleme için Dubleks Dijital PCR Testi<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Ve Waters İnsan Fekal ilişkili HF183 Marker

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Çevre

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of taxonomic and functional groups in environmental samples. Used in combination with a reverse transcriptase reaction (RT-q-PCR), it can also be employed to quantify gene transcripts. q-PCR makes use of highly sensitive fluorescent detection chemistries that allow quantification of PCR amplicons during the exponential phase of the reaction. Therefore, the biases associated with &#39;end-point&#39; PCR detected in the plateau phase of the PCR reaction are avoided. A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. First, a method for the co-extraction of DNA and RNA from coastal sediments, including the additional steps required for the preparation of DNA-free RNA, is outlined. Second, a step-by-step guide for the quantification of 16S rRNA genes and transcripts from the extracted nucleic acids via q-PCR and RT-q-PCR is outlined. This includes details for the construction of DNA and RNA standard curves. Key considerations for the use of RT-q-PCR assays in microbial ecology are included.

A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.

Gerçek zamanlı PCR ile Kıyı tortulları ve Niceleme 16S rRNA Genler ve Transkriptler eşzamanlı DNA-RNA Ekstraksiyon

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Kanser Araştırmaları

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Genetik

Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA sequence variation on a large scale. Specifically, detecting insertions and deletions (indels) at gene-edited sites generated by CRISPR guide RNA (gRNA)/Cas9-mediated non-homologous end-joining (NHEJ) is important for assessing the fidelity of the mutagenesis and the frequency of unintended changes. We describe here a protocol for digital-droplet PCR (ddPCR) that is well-suited for high-throughput NHEJ analysis. While this method does not produce data that identifies individual sequence variation, it provides a quantitative estimate of the sequence variation within a population. Additionally, with appropriate resources, this protocol can be implemented in a field-site laboratory setting more easily than next-generation or Sanger sequencing. ddPCR also has a faster turn-around time for results than either of those methods, which allows a more quick and complete analysis of genetic variation in wild populations during field trials of genetically-engineered organisms.

This protocol provides the steps from DNA extraction to experimental set-up for digital droplet PCR (ddPCR), including analysis for the identification and quantification of non-homologous end-joining (NHEJ) events at target sites following gRNA-induced Cas9 cleavage and DNA repair. Other uses of this method include applications such as polymorphism detection and gene-editing variant verification.

Genetiği Değiştirilmiş Anopheline Sivrisinek Popülasyonlarındaki Indels Mutasyonlarını Tespit Etmek için Dijital Damlacık PCR

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and animal tissues (Figure 1). Direct PCR is based on specially engineered Thermo Scientific Phusion and Phire DNA Polymerases, which include a double-stranded DNA binding domain that gives them unique properties such as high tolerance of inhibitors.
PCR-based target DNA detection has numerous applications in plant research, including plant genotype analysis and verification of transgenes. PCR from plant tissues traditionally involves an initial DNA isolation step, which may require expensive or toxic reagents. The process is time consuming and increases the risk of cross contamination1, 2. Conversely, by using Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit the target DNA can be easily detected, without prior DNA extraction. In the model demonstrated here, an example of derived cleaved amplified polymorphic sequence analysis (dCAPS)3,4 is performed directly from Arabidopsis plant leaves. dCAPS genotyping assays can be used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) by SNP allele-specific restriction endonuclease digestion3. 
Some plant samples tend to be more challenging when using Direct PCR methods as they contain components that interfere with PCR, such as phenolic compounds. In these cases, an additional step to remove the compounds is traditionally required2,5. Here, this problem is overcome by using a quick and easy dilution protocol followed by Direct PCR amplification (Figure 1). Fifteen year-old oak leaves are used as a model for challenging plants as the specimen contains high amounts of phenolic compounds including tannins. 
Gene transfer into mice is broadly used to study the roles of genes in development, physiology and human disease. The use of these animals requires screening for the presence of the transgene, usually with PCR. Traditionally, this involves a time consuming DNA isolation step, during which DNA for PCR analysis is purified from ear, tail or toe tissues6,7. However, with the Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit transgenic mice can be genotyped without prior DNA purification. In this protocol transgenic mouse genotyping is achieved directly from mouse ear tissues, as demonstrated here for a challenging example where only one primer set is used for amplification of two fragments differing greatly in size.

The Direct PCR approach presented here facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified plant and animal tissue.

Önce DNA Saflaştırma olmadan Bitki ve Hayvan Örnekleri genotiplendirmesi

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Biyoloji

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

İç Pozitif Kontrol ile Kantitatif Recombinase Polimeraz Amplifikasyon Testi Geliştirme

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

Düşük MW'lı DNA'yı Zenginleştirerek Çevresel AMR'yi Değerlendirmek için Etkili Teknik

Enhanced Extraction of Low-Molecular Weight DNA from Wastewater for Comprehensive Assessment of Antimicrobial Resistance

Environmental surveillance is recognized as an important tool for assessing public health in the post-pandemic era. Water, in particular wastewater, has emerged as the source of choice to sample pathogen burdens in the environment. Wastewater from open drains and community water treatment plants is a reservoir of both pathogens and antimicrobial resistance (AMR) genes, and frequently comes in contact with humans. While there are many methods of tracking AMR from water,&#160;isolating good-quality DNA at high yields from heterogeneous samples remains a challenge. To compensate, sample volumes often need to be high, creating practical constraints. Additionally, environmental DNA is frequently fragmented, and the sources of AMR (plasmids, phages, linear DNA) consist of low-molecular-weight DNA. Yet, few extraction processes have focused on methods for high-yield extraction of linear and low-molecular-weight DNA. Here, a simple method for high-yield linear DNA extraction from small volumes of wastewater using the precipitation properties of polyethylene glycol (PEG) is reported. This study makes a case for increasing overall DNA yields from water samples collected for metagenomic analyses by enriching the proportion of linear DNA. In addition, enhancing low-molecular-weight DNA overcomes the current problem of under-sampling environmental AMR due to a focus on high-molecular-weight and intracellular DNA. This method is expected to be particularly useful when extracellular DNA exists but at low concentrations, such as with effluents from treatment plants. It should also enhance the environmental sampling of AMR gene fragments that spread through horizontal gene transfer.

Yazar Spotlight: Kültür Tabanlı Teknikleri ve Genomiği Birleştirerek Çevresel Antimikrobiyal Direnci Anlama ve Tespit Etme

Here, we present a simple technique to assess environmental antimicrobial resistance (AMR) by enhancing the proportion of low-molecular-weight extracellular DNA. Prior treatment with 20%-30% PEG and 1.2 M NaCl allows detection of both genomic and horizontally transferred AMR genes. The protocol lends itself to a kit-free process with additional optimization.

Antimikrobiyal Direncin Kapsamlı Değerlendirmesi için Atık Sudan Düşük Moleküler Ağırlıklı DNA'nın Gelişmiş Ekstraksiyonu 

Environmental surveillance is recognized as an important tool for assessing public health in the post-pandemic era. Water, in particular wastewater, has ...

ÇevreSEL DNA Uygulamaları için Türlere Özgü Nicel PCR Testlerinin Geliştirilmesi ve Testi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Eşzamanlı Niceleme için Dubleks Dijital PCR Testi

Gerçek zamanlı PCR ile Kıyı tortulları ve Niceleme 16S rRNA Genler ve Transkriptler eşzamanlı DNA-RNA Ekstraksiyon

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Genetiği Değiştirilmiş Anopheline Sivrisinek Popülasyonlarındaki Indels Mutasyonlarını Tespit Etmek için Dijital Damlacık PCR

Önce DNA Saflaştırma olmadan Bitki ve Hayvan Örnekleri genotiplendirmesi

İç Pozitif Kontrol ile Kantitatif Recombinase Polimeraz Amplifikasyon Testi Geliştirme

Antimikrobiyal Direncin Kapsamlı Değerlendirmesi için Atık Sudan Düşük Moleküler Ağırlıklı DNA'nın Gelişmiş Ekstraksiyonu

Antimikrobiyal Direncin Kapsamlı Değerlendirmesi için Atık Sudan Düşük Moleküler Ağırlıklı DNA'nın Gelişmiş Ekstraksiyonu

Antimikrobiyal Direncin Kapsamlı Değerlendirmesi için Atık Sudan Düşük Moleküler Ağırlıklı DNA'nın Gelişmiş Ekstraksiyonu