Arabidopsis örnekleri ve ilgili PCR primerleri için biz Profesör Jaakko Kangasjärvi ve grubu, Bitki Stres Grubu, Bitki Biyolojisi, Biosciences Bölümü, Helsinki Üniversitesi ederim. Geleneksel yöntem ile deneyler Bayan Airi Lamminmäki tarafından yapılmıştır. Transgenik fare örnekleri Dr Jaana Vesterinen, Biyotıp / Biyokimya Enstitüsü, Helsinki Üniversitesi tarafından sağlandı. Harris Uni-Core ve Harris Kesme Mat Tüm diğer ticari markalar Thermo Fisher Scientific Inc ve iştiraklerinin mülkiyetindedir Shunderson Communications Inc ticari markalarıdır.

1. Doğrudan Protokolü Arabidopsis Bitki Bireylerin genotiplendirmesi <ol><li> Arabidopsis bitki yaprağı doğrudan dCAPS genotipleme tahlil başlamak için, ilk olarak Tablo 1&#39;de açıklandığı phire Bitki Direkt PCR Kit kullanarak 20 veya 50 ul PCR reaksiyonları formüle. </li><li> Sonraki Harris Uni-Core ve Harris Kesme Mat kullanarak Arabidopsis bitki yaprak bir 0.50 mm yumruk kesti. Sıkıca zımba Holding, doku içine kesme kenarına basın ve ileri geri puncher döndürün. </li><li> PCR reaksiyon karışımı içine zımba diski çıkarmak için dalgıç basın. Örnek PCR çözüm içine düşer ve tüp duvarları sopa değil emin olun. </li><li> 2% NaClO çözelti içine batırarak çapraz bulaşmayı önlemek için her örnek arasındaki delici ve kesici kenar temizleyin. Dalgıç kadar basın ve aşağı birkaç kez ve temiz bir kağıt havlu ile kesme kenarı silin. Kesme mat de olmalıdırnumuneler arasındaki durulanır. </li><li> Daha sonra, bir termo Scientific kullanmak piko Cycler ve Thermo Scientific piko PCR Plate Tablo 2 &#39;de tarif edilen döngü koşulları kullanılarak PCR reaksiyonları gerçekleştirmek için 24-iyi termal. PCR reaksiyonları, aynı zamanda, geleneksel PCR termal cycler&#39;ların içinde gerçekleştirilebilir. </li><li> PCR sonra, bitki materyali aşağı spin. Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne 5 ul süpernatan aktarın. Su 4 ul ve restriksiyon enzimi, SspI 1 ul ekleyin. Yavaşça karıştırın ve tüpün dibinde içeriği toplamak için kısaca aşağı doğru döndürün. 37. az bir saat boyunca reaksiyon karışımı inkübe ° C. 20 dakika süreyle 65 ° C&#39;de inkübe edilerek kısıtlama enzim inaktive eder. </li><li> Bitki dokuları doğrudan DNA yükselterek zaman, PCR ürünleri restriksiyon sindirimi enzimi ile etkileşime girebilir bitki ve PCR-türetilmiş bileşenler içerir. Bu nedenle, ya da seyreltik (örn., 1:2 veya su 1:3) ya da t önce PCR ürünü temizlemek için gerekli olabilecekböyle Thermo Scientific GeneJET PCR Saflaştırma Kiti gibi uygun bir ticari kit kullanılarak, örneğin sonraki sindirim,. </li><li> , Sınırlama enzimi özümlemesi takiben, bir agaroz jeli üzerinde analiz çıkan parçalar. Reaksiyon için 5x yükleme tampon 2.5 ul ekle ve nihai karışım, 10 ul ile agaroz jel elektroforezi gerçekleştirir. </li></ol> 2. 15 yaşındaki Oak Spesifik DNA parçaları yükselterek Seyreltme Protokolü kullanarak Yapraklar <ol><li> Başlamak için, meşe yaprağı 2 mm yumruk kesti. </li><li> Phire Bitki Direkt PCR Kit ile birlikte Sulandırma Tamponu 20 ul içine örneği yerleştirin. Delici ve kesici kenar temizleyin ve daha önce olduğu gibi mat kesme. </li><li> Tüp duvara kısaca basarak 100 ul pipet ucu ile yaprak örneği Crush. Bitki materyali bağlı dilüsyon protokolü bazen örnek ezilmeden iyi çalışır. </li><li> T kadar mikrosantrifüj kısaca örnekleri Spino reaksiyon Tüplerin tabanında yer almaktadır. </li><li> Süpernatan PCR içinde doğrudan kullanılabilir, ya da örnek türüne bağlı olarak steril su 1:10 ya da 1:100 dilüe edilebilir. Bir 20 ul PCR reaksiyonu için şablon olarak süpernatan ya da seyreltme 1 ul 0.5 ul kullanın. Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi reaksiyonu hazırlayın. </li><li> Reaksiyonları hazırlanır sonra, bir Thermo Scientific kullanmak piko Cycler ve Thermo Scientific piko PCR Plate Tablo 2 &#39;de tarif edilen döngü koşulları kullanılarak PCR reaksiyonları gerçekleştirmek için 24-iyi termal. PCR reaksiyonları, aynı zamanda, geleneksel PCR termal cycler&#39;ların içinde gerçekleştirilebilir. </li><li> PCR sonra, reaksiyon için 5x yükleme tamponu 5 ul ekleyin ve nihai karışım, 15 ul ile agaroz jel elektroforezi gerçekleştirir. </li></ol> 3. Seyreltme Protokolü kullanarak Transgenik Farelerin genotiplendirmesi <ol><li> M 2 mm yumruk koyarak transgenik fareler üzerinde seyreltme protokolü Başlayanphire Hayvansal Doku Direkt PCR Kit ile birlikte DNARelease Katık 0.5 ul içeren Sulandırma Tamponu 20 ul ouse kulak. </li><li> 98 2 dakika inkübasyon, ardından 2 dk ° C&#39;de için numuneler oda sıcaklığında inkübe </li><li> Reaksiyon tüplerin alt olana kadar bir mikrosantrifüj içinde kısaca örnekleri Spin. </li><li> Tablo 3 &#39;de tarif edildiği gibi hazırlanan bir 20 ul PCR reaksiyonu için şablon olarak 1 ul süpernatan kullanımı. Hemen kullanılmak üzere olmayan herhangi bir Süpernatant yeni bir tüpe aktarılmıştır ve -20 ° C&#39;de saklanabilir </li><li> Daha sonra, bir termo Scientific piko 24-iyi termal döngü cihazı ve Thermo Scientific piko PCR Plate Tablo 4 &#39;de tarif edilen döngü koşulları kullanılarak PCR reaksiyonları gerçekleştirmek için kullanır. Yine, PCR reaksiyonları, aynı zamanda, geleneksel PCR cycler&#39;ların içinde gerçekleştirilebilir. </li><li> PCR sonra, reaksiyon için 5x yükleme tamponu 5 ul ekle ve agaroz jel elektroforez w gerçekleştirmekMeydana gelen karışım, Vizyonunda 15 ul. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar DCAPS teknikte ilgi SNP içinde sınırlandırma bölgesi ya da katılabilmekte ya da hedef DNA bir ya da daha fazla uyumsuzlukları ile bir PCR primer ile yok edilir. Arabidopsis bitki bireylerin Genotiplendirme doğrudan yaprak yumruklar gelen dCAPS tekniği ile yapıldı. Amplifiye ürünler sindirilir ve her bireyin genotipinin ortaya çıkan parçalar (Şekil 2) jel elektroforezi ile analiz edildi. Bu örnekte, Arabidopsis genom ilgi SNP sitesi (G ya da A alleli) içeren 160 bp PCR ürünleri phire Plant doğrudan PCR Kit ile bitkinin yaprak zımbalar amplifiye edildi. Ileri primer ilgi SNP (A aleli) dahil, ancak, hedef DNA bir SspI özel sınırlama alanı yaratmak, 3 &#39;ucunda bir uyumsuzluk içerdiğiSNP (Şekil 2B) diğer allel içinde. Seyreltme protokolleri fenolik bileşikler, yüksek konsantrasyonu nedeniyle bu tür meşe yaprağı gibi zorlu bitki materyali, için gereklidir. Seyreltme protokolü kullanılarak burada açıklandığı gibi, chloroplastic DNA 297 bp fragmanı 3 aşamalı bir protokol kullanılarak büyütüldü. Dilüsyondan ile Oak yaprak örneklerinde pozitif ve negatif kontroller ek olarak, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Phire Hayvansal Doku Direkt PCR Kit için transgenik fareler için 1500 bp ve 200 bp hem doğru boyutlu ürünlerin bol verimi sonuçlanan bir primer seti büyük bir boyut farkı olan iki parçalarının amplifikasyonu için kullanılan zorlu bir protokol ile istihdam edildi vahşi tip farelerde (Şekil 4). Heterozigot farelerde zayıf üst bant aynı primer çifti için iki şablon (alleli) ve rekabet nedeniyle, ancak, genotiping sonuçlar açık bulunmaktadır. Seyreltme protokol kullanılarak hazırlanan numunelerin stabilitesi de test edilmiştir. Elde edilen sonuçlar, seyreltme numuneler, en az bir yıl süre ile -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir olduğunu göstermektedir. Ayrıca, tekrarlanan donma / çözülme döngüsü anlamlı reaksiyon (Şekil 5) etkilememiştir. Ayrıca phire DNA Polimeraz ve sıcak başlangıç ​​Taq polimeraz ve saflaştırılmış DNA (Şekil 6) göre doğrudan PCR yöntemiyle fare kulak doku örneklerinden sağlam amplifikasyon olduğu gösterilmiştir. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Bileşenleri </td><td fo:width=".75in"> 20 ul reaksiyon </td><td fo:width=".75in"> 50 ul reaksiyon </td><td fo:width=".75in"> Final Conc. </td></tr><tr><td> H2O </td><td> 20 ul ekle </td><td> 5 ekle0 ul </td><td></td></tr><tr><td> 2x phire Bitki PCR Tamponu </td><td> 10 ul </td><td> 25 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Astar A </td><td> X ul </td><td> X ul </td><td> 0.5 uM </td></tr><tr><td> astar B </td><td> X ul </td><td> X ul </td><td> 0.5 uM </td></tr><tr><td> Phire Hot Start II DNA Polimeraz </td><td> 0.4 ul </td><td> 1 ul </td><td></td></tr><tr><td> Örnek / doğrudan protokol </td><td></td><td> 0.50 mm yumruk </td><td></td></tr><tr><td> Örnek / seyreltme protokolü </td><td> 0.5-1 ul </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1.<html> Bitki PCR reaksiyon şartları bu protokolü kullanılmıştır. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Döngü Adım </td><td fo:width=".5in"> Temp. </td><td fo:width=".5in"> Zaman </td><td fo:width=".4in"> Döngüler </td></tr><tr><td> İlk denatürasyon </td><td> 98 ° C </td><td> 5 dk </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Denature * Tavlama Uzatma </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 sn 5 sn 20 sn </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Nihai Uzatma </td><td> 72 ° C 4 ° C </td><td> 1 dakika tutmak </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Bitki PCR BİSİKLET koşulları bu protokolü kullanılmıştır. At * Tm hesaplayıcıoscientific.com / pcrwebtools &quot;hedef =&quot; phire Hot Start II DNA polimeraz ile kullanılmak için primerler için Tm belirlerken _blank &quot;&gt; www.thermoscientific.com / pcrwebtools tavsiye edilmektedir. primerler için tavsiye edilen tavlama sıcaklık ≤ 20 nt kadardır webtool tarafından verilen daha düşük Tm. primerler&gt; 20 nt için bir tavlama sıcaklık 3 ° &#39;lik C webtool tarafından verilen daha düşük Tm daha yüksektir. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Bileşenleri </td><td fo:width=".75in"> 20 ul reaksiyon </td><td fo:width=".75in"> Final Conc. </td></tr><tr><td> H2O </td><td> 20 ul ekle </td><td></td></tr><tr><td> 2x phire Hayvansal Doku PCR Tamponu </td><td> 10 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Astar A </td><td> X ul </td><td> 0.5 uM </td></tr><tr><td> astar B </td><td> X ul </td><td> 0.5 uM </td></tr><tr><td> Phire Hot Start II DNA Polimeraz </td><td> 0.4 ul </td><td></td></tr><tr><td> Örnek / seyreltme protokolü </td><td> 1 ul </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 3. Hayvansal Doku PCR için reaksiyon koşullarının bu protokolü kullanılmıştır. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Döngü Adım </td><td fo:width=".5in"> Temp. </td><td fo:width=".5in"> Zaman </td><td fo:width=".4in"> Döngüler </td></tr><tr><td> İlk denatürasyon </td><td> 98 ° C </td><td> 5 dk </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Denature * Tavlama Uzatma </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 sn 5 sn 20 sn ≤ 1 kb 20 sn / kb&gt; 1 kb </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Nihai Uzatma </td><td>72 ° C 4 ° C </td><td> 1 dakika Tutmak </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tablo 4. Bu protokolde kullanılan Hayvansal Doku PCR için Bisiklete binme koşulları. * Olarak Tm hesap makinesi <a href="http://www.thermoscientific.com/pcrwebtools" target="_blank">www.thermoscientific.com / pcrwebtools</a> phire Hot Start II DNA polimeraz ile kullanılmak için primerler için Tm belirlerken tavsiye edilir. Primerler ≤ 20 nt için önerilen bir tavlama sıcaklık webtool tarafından verilen daha düşük Tm eşittir. Primerler&gt; 20 nt için bir tavlama sıcaklığı 3 kullanın ° C webtool tarafından verilen düşük Tm daha yüksektir. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Doğrudan PCR iş akışı. Direkt PCR iki alternatif protokoller kullanılarak yapılabilir. Doğrudan protokol örneği küçük bir miktar doğrudan bilgisayara eklenirR reaksiyonu. Seyreltme protokol numune malzemeden DNA serbest bırakmak için PCR önce, kısa bir ön-kuluçka adım kullanmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. Yaprak yumruklar doğrudan dCAPS tekniği ile Arabidopsis bitki bireylerin genotiplendirmesi. A) Şekil 2A dCAPS testinin prensibi gerçekleştirilir göstermektedir. İlgi SNP içinde sınırlandırma bölgesi ya da katılabilmekte ya da hedef DNA bir ya da daha fazla uyumsuzluğu olan bir primer kullanılarak PCR ile uzaklaştırılır. PCR ürünleri sindirilir ve elektroforezi ile analiz edildiğinde çıkan parçalar her bireyin genotipinin ortaya koymaktadır. B) Bitki yapraklarından 0.50 mm yumruklar 50 ul PCR reaksiyonlarında doğrudan yerleştirildi edilir. SNP sitesi (G veya A alleli) içeren 160 baz çiftlik PCR ürünleri primerleri A alleli için eşsiz bir SspI sitesini tanıtan ile amplifiye edildi. Arıtılmadan PCR ürünleri Diges idiSspI restriksiyon enzimi ile ted. Elde edilen fragman, bir% 3 agaroz jeli üzerinde analiz edilmiştir. Lane M boyut işaretleyici olarak kullanılabilir; şerit A ve G&#39;nin her biri numune SNP allel karşılık gelir. Elde edilen sonuçlar PCR ve restriksiyon sindirimi (veriler gösterilmemiştir) tarafından takip DNA ekstraksiyonu geleneksel analizi ile teyit edilmiştir. Şablon DNA olmadan negatif kontrol reaksiyonları kurmak testi dahil ve sindirim (veriler gösterilmemiştir) gerçekleştirmeden önce gerçek PCR reaksiyonları ile paralel ayrı bir agaroz jel üzerinde çalışıldı. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3.jpg" alt="Şekil 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3highres.jpg" /> Şekil 3,. Seyreltme protokolü meşe yaprağı örnekleri kullanarak. Seyreltme protokolü (1:100, 1:10, 1 farklı dilüsyonlarda meşe yaprağı örnekleri (3-adım protokolü, 62 ° C&#39;de tavlama) içinde chloroplastic DNA 297 bp parçasının büyütülmesi için kullanılan : 1 ve 2:1) ve pozitif ve negatif controls [C +: C-: Hiçbir şablon DNA negatif kontrol saflaştırılmış DNA (Arabidopsis), pozitif kontrol]. Örnek isimlendirme numune toplama site (Finlandiya kasaba) ve numaralandırma örnek temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig4.jpg" alt="Şekil 4," /> Şekil 4. Seyreltme protokolü kullanarak bir primer çifti ile transgenik farelerin genotiplendirmesi. Dokuz ayrı fareler (şerit 1-9) Kulak dokuların DNARelease Katkı dahil Sulandırma Tamponu 20 ul yerleştirildi. Oda sıcaklığında inkübe edilmesi ve sonra, 98 ° C, 1 ul süpernatan 20 ul PCR tepkimesinde bir şablon olarak kullanılmıştır. Fragment boyutları: 1500 bp (transgenik) ve 200 bp (yabani-tip). <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> Şekil 5,. Numuneler uzun süreli depolama boyunca stabildir. Fare kulak doku örnekleri inc olan seyreltme protokolüne göre hazırlanmış<html> DNARelease katkı maddesi de dahil olmak üzere seyreltme tamponu 20 ul içinde ubated ve tekrarlanan donma / çözülme (kulvar 1) tabi tutuldu bir yıl (kulvar 2) için -20 ° C &#39;de depolandığı ya da PCR (yol 3) için hemen kullanılmıştır. Amplifiye parçası boyutları 900 bp 1.500 bp ve 3.200 bp idi. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6. Phire Hayvansal Doku Direkt PCR Kit sıcak bir başlangıç ​​Taq DNA polimeraz ile birlikte ticari bir DNA arıtma sistemi geride bırakıyor. Dört amplikonlarının (0.5-1.5 kb) phire Hayvansal Doku Direkt PCR Kit seyreltme protokolü kullanarak fare kulak dokulardan amplifiye edildi. Karşılaştırma için, DNA ilk olarak ticari bir DNA çıkarma kiti kullanılarak ve aynı parçaları üreticilerin önerilerine uygun olarak sıcak bir başlangıç ​​Taq DNA polimeraz kullanılarak amplifiye edildi saflaştırılmıştır. Sadece phire Hayvansal Doku Direkt PCR Kit ile başarıyla güçlendirilmiş dört amplikonlarının vardı. T &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig7.jpg" alt="Şekil 7" /> Şekil 7. Kez / tüketilen reaktifleri. Tahmini ile iş akışı Evrensel karşılaştırılması Thermo Scientific Direkt PCR yaklaşımı DNA izolasyonu yaklaşımı, Ekstraksiyon tampon yaklaşımı ve PCR tampon yaklaşımı ile karşılaştırılır. Önceki PCR adım her yaklaşım için tahmini süre kırmızı metin listelenir. Thermo Scientific Direkt PCR yaklaşımı PCR öncesi numune hazırlama için sadece 0-4 dakika sürer. Her bir yöntem Aşağıda, tüketilen reaktifler listelenmiştir. Thermo Scientific Direkt PCR yaklaşımın diğer yöntemlere kıyasla reaktiflerin az miktarda kullanır. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3844/3844fig7large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue.">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).</li><li>Kim, C. S., Lee, C. H., Shin, J. S., Chung, Y. S., Hyung, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+isolation+of+high+quality+genomic+DNA+from+fruit+trees+and+conifers+using+PVP.">A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP.</a> Nucleic Acids Research. 25, 1085-1086 (1997).</li><li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dCAPS,+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms:+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics.">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> The Plant Journal. 14, 387-392 (1998).</li><li>Michaels, S. D., Amasino, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+method+for+detecting+single-nucleotide+changes+as+polymorphic+markers+by+PCR.">A robust method for detecting single-nucleotide changes as polymorphic markers by PCR.</a> The Plant Journal. 14, 381-385 (1998).</li><li>John, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+RNA+and+DNA+from+plants+containing+polyphenolics.">An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2381-23 (1992).</li><li>Wang, Z., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+mouse+tails.">Extraction of DNA from mouse tails.</a> BioTechniques. 41, 410-412 (2006).</li><li>Malumbres, M., Mangues, R., Ferrer, N., Lu, S., Pellicer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+High+Molecular+Weight+DNA+for+Reliable+Genotyping+of+Mice.">Isolation of High Molecular Weight DNA for Reliable Genotyping of Mice.</a> BioTechniques. 22, 1114-1119 (1997).</li><li>Yang, Y., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+Leaves+Using+AnyDirect+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis Leaves Using AnyDirect system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40, 444-447 (2007).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory. , (1989).</li><li>Meldgaard, M., Bollen, P. J. A., Finsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+method+for+sampling+and+extraction+of+mouse+DNA+for+PCR.">Non-invasive method for sampling and extraction of mouse DNA for PCR.</a> Laboratory Animals. 3, 413-441 (2004).</li></ol>

Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Thermo Fisher Scientific, Inc tarafından desteklenen

Burada gösterilen doğrudan PCR yaklaşımı zaman gerekli azaltılması ve bitki ve hayvan genotipleme (Şekil 7) için akışı kolaylaştırmak üzere doğrudan arıtılmadan örneklerinin küçük miktarlarda PCR amplifikasyonu için bir olanak sağlar. Ayrıca burada gösterilen doğrudan PCR yaklaşımı (Şekil 3) ile kombinasyon halinde seyreltme protokolünün kullanılmasıdır. Seyreltme protokolü zor örnekleri (bileşikler müdahale içeren örneğin yaşlı bitki yaprakları, bitki türleri) veya uzun (veya GC-zengin) amplikonlarının ile tavsiye edilir. Reaksiyon optimizasyonu için izin veren yeni bir doğrudan PCR deneyi, başlangıç ​​Bu protokol, özellikle yararlıdır. Protokol, doku malzemesi ve / veya kullanılan primerler farklılıklar nedeniyle düşük ürün verimleri gibi zaman zaman zorlukları gidermek için bir araç olarak hizmet edebilir. Seyreltme protokolü genelinde örnek bir tüketilen değildir sağlarken Ayrıca, aynı örnekten birden fazla reaksiyonlar çalıştırırken kullanmakreaksiyon. PCR için bitkilerden DNA arındırmak için, kongre potansiyel PCR analizi 8 engelliyor olabilir çeşitli bileşenleri kullanılarak DNA izolasyonu takiben hücre lizis yapılmasıdır. Yüksek fenolik içerik, polivinilpirolidon ilavesi ile özellikle zor bitkiler için geleneksel bir hücre parçalama 2,5 takiben DNA bağlama bileşikleri çıkarmak için kullanıldı. Açıkça burada olduğu gibi, bu karmaşık, zaman yoğun adımları hedef DNA tespit phire Bitki Direkt PCR Kit kullanımı ile önlenebilir. Hücre parçalama ve DNA izolasyonu adımları doğrudan Arabidopsis bitki yaprakları (Şekil 2) duyarlı dCAPS teknikler kullanılarak atlanabilir. Burada gösterildiği gibi, seyreltme protokol etkili bir PCR (Şekil 3) ile karışabilir sorunlu bileşenlerinin varlığını yönetir. Geleneksel olarak, hayvan genotipleme için bir önkoşul isolati olduorganik çözücü ekstraksiyonu, alkol yağış ve santrifüj adımları 6,9,10 takip deri ve bağ dokusu, sindirimi proteinaz K ile uzun bir inkübasyon ile karakterize bir toksik, zaman alıcı bir süreç yoluyla hayvan dokusu genomik DNA üzerinde. Olarak burada gösterdi, bu sürecin basitleştirilmesi transgenik farelerin önceden DNA arıtma (Şekil 4) olmadan genotiplenmiştir izin vererek, phire Hayvansal Doku Direkt PCR Kit kullanımı yoluyla elde edilir. Bu makale gösterilen örnek, özellikle tek bir primer seti büyük bir boyut farkı olan iki parçalarının amplifikasyonu için kullanılan gibi zordur. Protokol doğuştan gelen güç olmasına rağmen basit seyreltme protokol iki PCR ürünleri (Şekil 4) yüksek verimle sonuçlandı ile birlikte doğrudan PCR yaklaşımı kullanır. PCR tabanlı hedef DNA tespiti belirlemek için genotip analizi de dahil olmak üzere, araştırma alanında bir çok uygulama vargelişimi, fizyolojisi ve hastalık genlerin rolleri. Özel DNA polimeraz inhibitörü tolerans sayesinde, önceki protokol DNA arıtma olmadan en az sürede tamamlanabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Phire Bitki Direkt PCR Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-130 </td><td> 200 reaksiyonlar (50 ul her biri) </td></tr><tr><td> Phire Hayvansal Doku Direkt PCR Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-140 </td><td> 200 ilişkilerini de kullanmaya çalışıyorum (50 ul her biri) </td></tr><tr><td> Harris Uni-Core 0.35 mm (pembe) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-180s / L </td><td> Miktar: 5/25 </td></tr><tr><td> Harris Uni-Core 0.50 mm (mavi) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-185S / L </td><td> Miktar: 5/25 </td></tr><tr><td> Harris Mat 6,4 × 7,6 cm Kesme </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-190 </td><td> Miktar: 5 </td></tr><tr><td> SspI </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> ER0771 </td><td> 100 ul (100 reaksiyonlar) </td></tr><tr><td> Piko 24-Well Termal Cycler </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TCP0024 </td><td></td></tr><tr><td> 24-Peki Piko PCR Tabaklar </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SLP0241 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJET PCR Saflaştırma Kiti </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> K0701 K0702 </td><td> 50 preparatlarıyla 250 preparatlarıyla </td></tr></tbody></table>

genotyping of plant and animal samples without prior dna purification

Doğrudan PCR yaklaşımı, doğrudan arıtılmadan örnek küçük miktarlarda PCR amplifikasyon kolaylaştırır, ve çeşitli bitki ve hayvan dokuları (Şekil 1) için burada gösterilmiştir. Direkt PCR onları böyle inhibitörleri yüksek tolerans gibi benzersiz özellikleri veren bir çift iplikli DNA bağlayıcı etki alanı içeren özel tasarlanmış Thermo Scientific Phusion ve phire DNA polimerazlar esas alınmaktadır. PCR tabanlı hedef DNA tespiti bitki genotip analizi ve transgenlerin doğrulanması dahil olmak üzere bitki araştırma birçok uygulama vardır. Bitki dokuları PCR geleneksel pahalı veya toksik reaktifler gerektirebilir ilk DNA izolasyonu adım içerir. Süreci zaman alıcıdır ve çapraz kontaminasyon 1, 2 riskini artırır. Tersine, Thermo Scientific phire Bitki Direkt PCR kiti kullanılarak hedef DNA kolayca önceden DNA ekstraksiyonu olmadan tespit edilebilir. Bu modelde, burada bir göstermiştiryarılan amplifiye edilen polimorfik sekans analizi (dCAPS) 3,4 örnek Arabidopsis bitki yapraklarından direkt olarak yapılır. dCAPS genotipleme deneyleri SNP allel-spesifik endonükleazlar 3 ile tek nükleotid polimorfizmleri (SNP) tanımlamak için kullanılır. Bazı bitki örnekleri onlar gibi fenolik bileşikler gibi PCR ile müdahale bileşenleri içerir olarak doğrudan PCR yöntemleri kullanırken daha zor olma eğilimindedir. Bu durumda, bileşikler kaldırmak için ilave bir aşama geleneksel 2,5 gereklidir. Burada, bu sorun, doğrudan PCR amplifikasyonu (Şekil 1) takip ettiği bir hızlı ve kolay bir seyreltme protokolü kullanılarak bu sorunun üstesinden gelinmemektedir. Numune tanen içeren fenolik bileşikler içerdiği yüksek miktardaki olarak Onbeş yaşındaki meşe yaprağı zorlu tesisleri için bir model olarak kullanılmaktadır. Fareler içine gen aktarımı genel olarak develo genlerin rollerini araştırmak için kullanılmaktadırpment, fizyolojisi ve insan hastalıkları. Bu hayvanların kullanımı genellikle PCR ile, transgen varlığının taranması gerekir. Geleneksel olarak, bu kulak, kuyruk veya ayak dokuları 6,7 arındırılan PCR analizi için hangi DNA sırasında zaman alıcı bir DNA izolasyonu adım içerir. Bununla birlikte, Thermo Scientific phire Animal Tissue doğrudan PCR Kit transgenik fareler ile önceden DNA arıtma olmaksızın genotipleme edilebilir. Bu protokol genotipleme transjenik fare gibi bir primer kümesi boyutu büyük ölçüde farklılık gösteren iki parça arasında amplifikasyonu için kullanılan bir zorlu örneğin burada gösterildiği gibi, fare kulak dokular tarafından doğrudan elde edilir.

Watch this Scientific Journal Video about Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification at JoVE.com

Bitki ve Hayvan Örneklerinin Önceden DNA Saflaştırması Olmadan Genotiplenmesi | Biyoloji | Video

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Burada sunulan Direkt PCR yaklaşım doğrudan arıtılmadan bitki ve hayvan dokusu küçük miktarlarda PCR kolaylaştırır.

Önce DNA Saflaştırma olmadan Bitki ve Hayvan Örnekleri genotiplendirmesi

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

genotyping-of-plant-and-animal-samples-without-prior-dna-purification

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Plant Biology

Plant Reproduction

SCIENTISTS IN ACTION

31.0K Görüntüleme.  Thermo Fisher Scientific. Burada sunulan Direkt PCR yaklaşım doğrudan arıtılmadan bitki ve hayvan dokusu küçük miktarlarda PCR kolaylaştırır.

Video: Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biyoloji

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high purity DNA. Based on multi-well filtration for bacterial lysate clearance and DNA purification, this method creates a streamlined process for plasmid preparation. Filter plates containing silica-based media can easily be processed by vacuum filtration or centrifuge to yield appreciable quantities of plasmid DNA. Quantitative analyses determine the purified plasmid DNA is consistently of high quality with average OD260/280 ratios of 1.97. Overall, plasmid yields offer more pure DNA for downstream applications, such as sequencing and cloning. This streamlined method of using AcroPrep Advance Filter Plates allows for manual, semi-automated or fully-automated processing.

This protocol is a cost effective alternative for efficient parallel clarification and plasmid DNA purification from E. coli cultures. The AcroPrep Advance process starts with an optimized lysate clarification filter plate followed by purification on a high binding capacity DNA binding filter plate.

Prokaryotik Kültürler itibaren Plazmid DNA Aerodinamik Arıtma

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

Wild-tip ve Süs Çeşitler arasında ayırt A PCR tabanlı Genotiplendirme Yöntemi Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

Saf olmayan Arındırıcı: Sıralama Metagenomes ve Metatranscriptomes Kompleksi Hayvan ilişkili Örneklerinden

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

Domates Tüylü Roots Üretimi ile yüksek verim CRISPR Vektör İnşaat ve DNA Değişiklikler Karakterizasyonu

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs contribute to genetic variation among somatic cells in multicellular organisms and to evolution of unicellular eukaryotes. Sensitive methods for detecting eccDNA are needed to clarify how these elements affect genome stability and how environmental and biological factors&#160;induce their formation in eukaryotic cells. This video presents a sensitive eccDNA-purification method called Circle-Seq. The method encompasses column purification of circular DNA, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification of eccDNA, deep sequencing, and mapping. Extensive exonuclease treatment&#160;was&#160;required for sufficient linear chromosomal DNA degradation. The rolling-circle amplification step by &#966;29 polymerase enriched for circular DNA over linear DNA. Validation of the Circle-Seq method on three S. cerevisiae CEN.PK populations of 1010 cells detected hundreds of eccDNA profiles in sizes larger than 1 kilobase. Repeated findings of ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30,&#160;HXT6, HXT7 genes on circular DNA in both S288c and CEN.PK suggests that DNA circularization is conserved between strains at these loci. In sum, the Circle-Seq method has broad applicability for genome-scale screening for eccDNA in eukaryotes as well as for detecting specific eccDNA types.

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

Ökaryotik Hücrelerde gelen ekstrakromozomal dairesel DNA genom Arıtma

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hibrid-Cut: Dirençli Bir Bitki Doku Örnekleri Bir Geliştirilmiş Kesit Yöntemi

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Sorunlu Tesisi, Oomiçet ve fungal Örnekleri için Elektron Mikroskobu (SEM) Protokoller tarayarak

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

Önce DNA Saflaştırma olmadan Bitki ve Hayvan Örnekleri genotiplendirmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler