Tüm deneysel durumun dikkatlice optimize edildiği bu protokol, DEC-205 antikorunun OVA antijenine başarılı ve verimli bir kimyasal konjugasyonunu kolaylaştırmak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajları, protein antijen ve antikorunun esnek bir şekilde seçilmesine izin vemesi ve bu bileşenlerin genetik füzyona dayanmamasıdır. Bu protokolü ayrıca in vivo DC hedeflemesi için hepatit C virüs proteinleri ve anti-DEC-205 konjugeleri üretmek için de kullandık.
Bu aynı şekilde anti-tümör aşılama yaklaşımları için de değerli olabilir. Anti-DEC-205 üretimine başlamak için, %1 penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş 37 santigrat derece ISF-1 ortamının dokuz mililitresinde bir ila beş milyon çözünülmüş kriyo korunmuş NLDC 145 hücresinin bir mililitre hacmini yeniden depola, ve hücreleri 37 santigrat derecede inkübasyon için 25 santimetrekarelik bir hücre kültürü şişesine ve 24 ila 48 saat boyunca% 5 karbondioksite tohumlar. Hücreler% 70 izdiah süresine ulaştığında, tüm hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın.
Peletin 12 mililitre taze tam 37 derece ISF-1 orta derecesinde yeniden ıslatın ve hücreleri 75 santimetrekarelik bir şişede yeniden plakalayın. 48 ila 72 saatlik kültürden sonra, %70'lik birikme kültürünü iki yeni 75 santimetrekare şişenin her biri arasında bölün ve her şişeye altı mililitre taze komple ISF-1 ortamı ekleyin. Kültürler% 70 izdiah ulaştığında, tüm hücreleri toplamak ve her genişletilmiş NLDC 145 hücre süspansiyonunun 10 mililitresini ayrı PETG silindir şişelerine aktarmak için hücre kültürü şişe altlarını ve kültür yüzeylerini hücre süspansiyonu ile yıkamak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın.
Daha sonra her makara şişesi kültürüne ve kültürüne 37 santigrat derecede, % 5 karbondioksit ve üç gün boyunca dakikada 25 mermi ile 140 mililitre tam ISF-1 ortamı ekleyin. NLDC 145 süperndanktan antikor saflaştırması için, silikon tüpün ucunu süpernatan dolgulu kabın içine yerleştirin ve 800 mililitre süpernatantın bir Protein G Sepharose sütununda damla yönünde çalışmasına izin verin. Elution için, yirmi 1,5 mililitre tüpün her birine 1,5 molar Tris-HCL'nin 100 mikrolitresini ekleyin ve kauçuk fişi kolondan çıkarın.
Bir mililitre 0,1 molar glisini sütunun üst odasına aktarın ve eluent içeren antikorları hazırlanan 1,5 mililitre tüplerden birine toplayın ve her tüp için tekrarlayın. Tüm antikor toplandığında ve antikor içeren elutionlar birikmişse, 20 santimetre uzunluğundaki diyaliz tüpünün altını uygun bir diyaliz boru kapatma ile kapatın ve antikor elüasyonunu dikkatlice boruya boru haline alın. Diyaliz tüpünün üst kısmını ikinci bir kelepçe ile kapatın ve diyaliz tüpünün üst kelepçesini yüzen bir standa sabitleyin.
Pbs'in bir kabına manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin ve beheri manyetik bir karıştırıcının üzerine yerleştirin. Dört santigrat derecede gece diyalizden sonra, tam kadrandatın 10 kiloDalton moleküler ağırlık kesmeli bir santrifüj konsantratöre yüklenmesine izin vermek için bir kelepçe açın ve yoğunlaştırıcıyı 693 kez G ve dört santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin. Dönüşün sonunda, son bir ila 1,5 mililitre antikor çözeltisi elde edilene kadar ikinci bir santrifüjleme için santrifüj konsantratörü 10 mililitre PBS ile yükleyin.
OVA'yı anti-DEC-205 antikora çekmek için, oda sıcaklığında 1,5 saatlik bir inkübasyon için 1,5 mililitrelik bir tüpe 500 mikrogram OVA proteini, 240 mikrolitre taze hazırlanmış bir TCEP-HCL çözeltisi ve 560 mikrolitre steril ultra saf su ile desteklenmiş 200 mikrolitre PBS ekleyin. Aynı zamanda, bir ısıtma bloğunda dakikada 550 devirde 37 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyon için ikinci bir 1,5 mililitrelik tüpe 900 mikrolitre PBS'de 2,5 miligram anti-DEC-205 ve taze hazırlanmış 100 mikrolitre sülfo-SMCC ekleyin. Kuluçkaların sonunda, tuzdan arındırıcı sütunları gevşetilmiş kapaklarla yerleştirin ve altlardan bükülmüş 15 mililitrelik konik tüplere yerleştirin ve sıvıyı çıkarmak için sütunları santrifüj edin.
Santrifüjlemeden sonra, kolonları kapakları çıkarılmış yeni tüplere yerleştirin ve antikor sülfo-SMCC ve OVA TCEP-HCL çözeltilerini yavaşça çözelti başına bir sütunluk kompakt reçine yatağının ortasına yükleyin. Santrifüjlemeden sonra, kolonları atın ve antikor ve OVA çözeltilerini hemen hafif pipetleme ile karıştırın. Anti-DEC-205/OVA çözeltisini bir santrifüj protein konsantratörüne yükleyin ve konsantratörü PBS ile 15 mililitre hacme doldurun.
Konsantratörü 2.000 kat G ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüjleyin ve konsantratöre 10 mililitre PBS daha doldurun. Konsantrasyonu aynı santrifüj koşullarında en az sekiz dakika santrifüjledikten sonra, konsantre numuneyi üst odadan hafifçe toplayın. Batı blot analizi ile konjugasyonun başarısını doğrulamak için, bir protein standardı üzerindeki her numuneden bir aliquot'u bir SDS jeline yükleyin ve jeli standart SDS-PAGE analiz protokollerine göre çalıştırın.
Jel şişkinliğinden sonra, standart protokollere göre anti-DEC-205 veya OVA'yı tespit etmek için membranları yaban turpu peroksidaz konjuge antikorlarla lekelayın. Membranlar daha sonra her numunede ilgili proteinin varlığı için analiz edilebilir. ELISA tarafından konjugasyonun başarısını doğrulamak için, uygun bir 96 kuyu elisa plakasını kuyu başına 100 mikrolitre anti-OVA antikoru ile kaplayın ve anti-DEC-205/OVA'yı bir ila iki oranda seri olarak seyreltin ve mililitre başına altı mikrogramdan 93,8 nanograma kadar seyreltme elde etmek için tamponu engelleyin.
Oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için antikor kaplı plakanın uygun kuyularına her seyreltmeden 100 mikrolitre ekleyin. Kuluçkanın sonunda, oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyon için plakaya anti-DEC-205/OVA konjuge antikora karşı 100 mikrolitre yaban turpu peroksidaz konjuge antikoru ekleyin, ardından spektrofotometri ile renk reaksiyonunun analiz edilmesine izin vermek için her kuyuya 50 mikrolitre yaban turpu peroksidaz substratı ekleyin. Paralel Batı blot analizi, hem konjuge OVA'yı hem de eşli anti-DEC-205'i tespit etmek için kullanılabilir.
OVA için boyama, mevcutsa fazla serbest OVA'nın tespit edilmesine izin verecektir ve anti-DEC-205 için boyama, çıplak anti-DEC-205 ile konjuge arasındaki moleküler ağırlıktaki artışla konjugasyonun başarısını doğrular. ELISA, tespit edilen sinyal ile anti-DEC-205/OVA konjugantının başarılı bir şekilde üretilmesini gösteren analiz edilen protein miktarı arasındaki pozitif ilişki ile konjugasyonun başarısını değerlendirmek için de kullanılabilir. Akış sitometrisi ve immünofluoresans analizi, anti-DEC-205 çekirdeğinin kemik iliği türevi CD11c pozitif hücreleri verimli bir şekilde bağladığını açıkça göstermektedir.
Anti-DEC-205/OVA ile adjuvan ile aşılama, fare alıcılarında OVA ve adjuvan ile aşılamaya kıyasla OVA'ya özgü IgG titrelerinde artışa neden olan bir artışa nedendir. Ayrıca, anti-DEC-205/OVA, sadece OVA tarafından indükleneni önemli ölçüde aşan anti-DEC-205/OVA kaynaklı CD8-pozitif T hücre yanıtları ile aşırı spesifik CD4 ve CD8 pozitif T hücre yanıtlarını etkili bir şekilde indükler. OVA antijeninin anti-DEC-205 antikora başarılı bir konjugasyonu için, malzemelerin gösterildiği gibi hazırlanması ve konjugasyon adımlarının tutarlı koşullar altında gerçekleştirilmesi önemlidir.
Antijen ve antikorun başarılı bir şekilde konjugasyonundan sonra, bağlayıcı analiz ve patojen veya tümöre bağlı bağışıklığın indüksiyonu da dahil olmak üzere çok sayıda sonraki yaklaşım mümkündür.
