Bu yöntem, beyaz kan hücreleri nasıl aktive edilir gibi immünoloji alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, ve nasıl bireysel alerjenlere alerji gelişir? Bu sağlam ve tekrarlanabilir alerji fare modelinin en büyük avantajı, deneysel bir popülasyonla daha az varyans elde etmek için daha az farenin kullanılabilmesidir. Bağışıklık yanıtlarını kontrol etmek için yeni immünoterapiler in vivo etkinliği test bir başlangıç aracı olarak sağlam fare modelleri gerektirir.
Böylece, bu tekniğin etkileri alerji immünoterapi doğru uzanır. Bu yöntem alerjiler hakkında bilgi sağlasa da, istenmeyen antikor yanıtlarının hastalıkta önemli bir rol oynadığı otoimmünite gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni bireyler lipozomal nano tanecikleri veya fare çalışmalarında gerekli teknikler ile bir deneyim eksikliği nedeniyle mücadele edecek.
Proteine heterobifonksiyonel crosslinker 2.5 molar eşdeğer ekleyerek ve yaklaşık bir saat boyunca oda sıcaklığında bir salınımlı shaker üzerinde reaksiyon yerleştirerek başlayın. SPDP ile bir saatlik kuluçkadan sonra, 100 milimolar sodyum asetat ile dengelendirilen bir sütundaki proteini tuzdan arındırın ve kesirleri toplayın. 280 nanometre emiciliği belirleyin ve üst kesirleri birleştirin.
PBS sütununu yıkayın ve 5 ila 10 dakikalık kuluçka için birleştirilmiş protein fraksiyonlarına 25 milimolar dithiothreitol veya DTT ekleyin. Daha sonra, proteinin ve bağlayıcının azılılığına göre bağlanma oranının hesaplanmasına izin vermek için proteinin 280 ve 343 nanometre emicilerini ölçün. Daha sonra, PBS yıkanmış sütunun havuzlu kesirlerini çalıştırın ve gösterildiği gibi 280 nanometre ve üst kesir havuzuölçümü için kesirleri toplayın.
1x, 10 kat azı azı son konsantrasyonu ve yumuşak dönen bir son konsantrasyonu elde etmek için proteine uygun 100x DSPE-PEG2000-Maleimide hacmini ekleyin. Daha sonra, kapalı yuvarlak alt şişesinde azot altında bir gecede reaksiyon uyguluyor. Ertesi gün, çapraz bağlı dextran jel boncuk sütun üzerinde protein çalıştırın ve lipit bağlı protein in son havuzlu fraksiyonları kullanılabilir kadar dört santigrat santigrat de saklayın.
Her lipid doğru miktarı hesaplandıktan sonra, 12 mililitrelik borosilikat cam test tüpü içine tüm lipidler birleştirmek ve dikkatle azot ile kloroform darbe için üç mililitreşlik şırınga ve tüp kullanın. Daha sonra çözeltiyi bir gecede 100 mikrolitre DMSO ile lyophilize edin. Ertesi sabah, 12 mililitrelik lipid tüpüne bir mililitre lipid bağlantılı protein ekleyin ve sonication su banyosunda sonication su banyosunda sonication başına 30 ila 60 saniye sonication başına üç ila dört kez sonicate sonications arasında en az beş dakikalık dinlenme ile.
Son sonication sonra, ekstrüder yerleştirilen ekstrüzyon şırıngabirine örnek yükleyin ve ekstrüder diğer ucuna ekstrüzyon şırınga yerleştirin. Lipid polikarbonat 0.8 mikrometre membran yoluyla ekstrüzyon olarak boş şırınga dolduracaktır. Tam olarak monte edilmiş ekstruderi ısıtma bloğuna yerleştirin ve şırıngayı boşaltmak için yavaşça pistona bastırın.
Son ekstrüzyondan sonra lipozomları temiz bir şişeye aktarın ve az önce gösterildiği gibi polikarbonat 0.2 ve 0.1 mikrometrelik membranlar aracılığıyla lipitleri dışarı atın. Sonra, lipozomları 4 santigrat derecede saklayın. Antijenik lipozom aktivasyonuna B hücresi yanıtını izlemek için, kalsiyum akısı yükleme tamponunda 1,5 kat 10 ile yedinci splenositleri yeniden askıya alın ve hücrelere 1,5 mikromolar Indo-1 ekleyerek çözeltiyi karıştırmak için birkaç kez tüpte ters çevirin.
37 santigrat derecede 30 dakikalık su banyosu kuluçkasından sonra, ışıktan korunan, kalsiyum akısı yükleme tamponunun beş katını ekleyin ve Indo-1 etiketli hücreleri santrifüj edin. B hücreli gating için, anti-CD5 ve anti-B220 antikor ile leke hücreleri 0.5 mililitre yükleme tampon dört santigrat derece 20 dakika boyunca, ışıktan korunur. Kuluçka sonunda, hücreleri taze kalsiyum akısı yükleme tamponuyla yıkayın ve peleti 1-2 kez 10'da, analize kadar ışıktan korunan buz üzerinde depolamak için çalışan taze kalsiyum akısının mililitrebaşına yedinci hücrelere kadar yeniden askıya alın.
Daha sonra, bir kapaklı, beş mililitre, yuvarlak alt, polistiren tüp için hücrelerin 0,5 mililitre ekleyin ve bir su banyosunda 37 santigrat derece hücreleri ısıtın. Üç ila beş dakika sonra, tüpü sirkülasyon lu su banyosuna bağlı 37 derecelik su ceketli bir odaya aktarın ve tüpü akış sitometresindeki su ceketinde çalıştırın. Saniyede 5,000 ila 10, 000 olay topladıktan sonra, hücrelerin 15 ila 30 saniye stabilize olmasını bekleyin ve arka plan okuması oluşturmak için verileri en az 10 saniye toplayarak veri toplamaişlemini yeniden başlatın.
10 saniyelik işarette, hızlı bir şekilde akış sitometre tüp kaldırmak ve antijenik lipozomlar uygun deneysel konsantrasyon ekleyin. Sonra, hücreleri nabız girdap ve ek bir 3-5 dakika için sitometre üzerinde tüp okuyun. Hayvanları hassaslaştırmak için, her dört ila beş haftalık BALB / c kadın fare alıcı haftada bir kez üç hafta ve seyreltilmiş fıstık ekstresi 300 mikrolitre dördüncü hafta boyunca oral gavaj yoluyla kolera toksin içeren fıstık özü 200 mikrolitre teslim.
28. günde, PBS'de mililitre başına bir miligramlık son konsantrasyona fıstık ekstresi hazırlayın ve her duyarlı hayvanın temel vücut sıcaklığını ölçmek için rektal termometre kullanın. Tüm sıcaklıklar ölçüldüğünde, intraperitoneal enjeksiyon yoluyla her alıcıya 200 mikrolitre fıstık ekstresi uygulayın ve enjeksiyondan sonra bir saat boyunca her 15 dakikada bir rektal termometre ile vücut ısısını ölçün. Vücut ısısındaki bir düşüş yer fıstığına alerjisi olduğunu gösterir.
Yer fıstığına alerjisi olan farelerden splenositleri izole ettikten sonra, 27-gauge, 5/8-inç iğne ile donatılmış bir mililitrelik insülin şırınga kullanın intravenöz enjekte etmek için 1.5 kez 10 naif kuyruk damarları içine çıkarılan alerjik splenositler, duyarsız hayvanların kuyruk damarları içine. Evlat edinme den bir gün sonra, intravenöz ara h 2 antijenik lipozomlar 200 mikrolitre enjekte alerjik splenositler alınan her BALB / c farekuyruk damariçine. Lipozom enjeksiyonundan iki hafta sonra fareleri i.p. ile güçlendirin.
çözünür Ara h 2 enjeksiyonu, 200 mikrolitre Ara h 2 gün 61 meydan takip. Daha sonra, her 15 dakikada bir rektal sonda ile vücut ısısını ölçün. Protein konjugasyonu, konjuge olmayan proteine kıyasla moleküler ağırlıkta artış gösteren bir azaltıcı jel çalıştırılarak gösterilebilir.
Antijenik lipozom uyarılmış B-hücre kalsiyum akı değerlendirmek için, B220-pozitif CD5-negatif B hücrelerinin seçimi ne izin canlı tek hücreleri kapısı. Zaman içinde Indo-1 menekşe karşı Indo-1 mavi floresan oranı daha sonra lipozom kaynaklı B hücreli aktivasyon miktarını değerlendirmek için analiz edilebilir. ELISA tarafından yer fıstığı ekstresi duyarlılaştırılmış farelerin serumunda Ara h 2-spesifik IgE ve IgG1'in ölçülmesi, Ara h 2-spesifik IgE ve IgG1 ile artırılan farelerin ölçülebilir Ara h 2-spesifik IgE ve IgG1 ile güçlendirilmiş hassasiyete sahip farelerin serumlarında ölçülebilir olduğunu göstermektedir.
Ara h 2 mücadelesi sırasında kaydedilen vücut sıcaklıkları, alerjik farelerin bu zorluğun ardından vücut ısılarında azaldığını gösterirken, saf farelerdeki vücut sıcaklıklarının tutarlı kaldığını ortaya koymaktadır. Bu prosedürü çalışırken, çok fazla protein ekstrüzyon zor yapabilir gibi, lipozomlar dahil olan lipid bağlı protein miktarını dikkatle takip etmek hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, alerjene özgü B ve T hücrelerinin izlenmesi ve sıralanması gibi diğer yöntemler, bu alerjene özgü hücrelerin tedavilere nasıl yanıt verdiklerine ilişkin ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.
Bu teknik, alerji alanında araştırmacılar için bu fare modeli kullanarak alerjik hastalık la mücadele yeni immünoterapiler keşfetmek için önünü açacaktır. Kolera toksini ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve kullanımı için kurallara yerel kurumsal biyolojik güvenlik standartlarına uygun olarak uyulması gerektiğini unutmayın.
