Bu çalışma, Berlin&#39;de Moleküler Tıp ve Charite Tıp Fakültesi Merkezi Delbrück Deneysel ve Klinik Araştırma Merkezi, Max bir işbirliğinden SW için Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WA 2.804) ve SW için bir üniversite hibe tarafından finanse edildi. Fon çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı ya da yazının hazırlanmasında herhangi bir rolü vardı. Biz laboratuvarda yaptığı staj sırasında teknik destek için Sayın Robert Westphal teşekkür ederim.

Tüm hayvan prosedürleri yürütme önce yerel kurumsal hayvan koruma kurulu tarafından onaylanması gerekir. MR ölçümleri sırasında anestezi ve fizyolojik izleme yeterli düzeyde (vücut ısısı, solunum hızı) vazgeçilmez gereksinimleri vardır. 1. Fare Kemik İliği-elde edilen dendritik hücreler üretimi <ol><li> C57BL kemik iliği hücreleri ayıklamak / 6 fareler daha önce 12 tarif. Bu protokol Geri 1992 13 yılına dayanıyor ve aslında Ralph M. Steinman (1.943-2.011), dendritik hücre 14 keşfeden grubu tarafından tanımlanmıştır. </li><li> Kısaca, fare ödün kısa bir süre sonra tibia ve fibula ayıklayın. Laminer akış kaputu (mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için) altında çalışan, yıkama orta (% 5 FBS, RPMI% 1 penisilin / streptomisin ve% 1 HEPES) 12 ile küçük bir Petri kabı içine kemik iliği yıkayın. </li><li> Bir cep Samandan yoluyla hücre süspansiyonu aktarıniçi özel (100 mikron göz açıklığı, naylon) steril bir 50 ml santrifüj tüpüne kemik ve artık doku kaldırmak için. Birkaç yıkama adımları ve bir parçalama adım 12 sonra, tripan mavi ve hemasitometre kullanarak canlı hücreleri saymak. </li><li> 400.000 hücre konsantrasyonunda ml&#39;lik kültür ortamı içinde yeniden süspanse -1 kemik iliği hücreleri (RPMI,% 10 FBS ile takviye edilmiş,% 1 penisilin / streptomisin,% 1 Hepes ve% 1 L-glutamin) fare granülosit 75 ng ml-1 ihtiva eden plazmid ile transfekte edilmiş fare GMCSF 293FT HEK hücreleri süpernatanlanndan elde makrofaj-koloni uyarıcı faktör (MGM-CSF). Petri kapları içinde hücre süspansiyonu, 10 ml (4 x 10 6 hücre) (100 mm x 20 mm) aktarın ve (37 ° C,% 5 CO2), bir CO2 inkübatöründe inkübe edin. 3. günde, 10 ml taze orta (75 ng ml -1 MGM-CSF sonu konsantrasyonu tutulması) ile eski orta doldurmak. 6. günde, eski orta 10 ml çıkarın ve doldurmak10 ml taze ortam ile (MGM-CSF son konsantrasyonu = 75 ng ml-1). 8. günde, eski orta 10 ml çıkarın ve 10 ml taze orta (MGM-CSF son konsantrasyonu = 150 ng ml -1) ile doldurmak. </li><li> Gün 10, 24 saat 1 mg ml -1 lipopolisakkarid (LPS) ile farklı DC olgun. </li></ol> 2. 19 F-zengin Parçacıklar ile dendritik hücreler etiketlenmesi <ol><li> 24 saat matürasyon adım (1.5), etiket DC boyunca 1 mM fluor zengin perfloro-15-taç eter-5-(PFCE) aynı zamanda 24 saat boyunca parçacıklar (500-560 nm). Bir hücre bozucu titanyum sonotrod ile ve 60 saniye için sürekli bir darbe programı (genlik% 100, güç = 250 W) kullanılarak (toplam hacmi 2.5 mL), Pluronic F-68 ve PFCE bulamaç büyük florin etiketli parçacıkları hazırlayın. </li><li> Yukarıdaki İnkübasyon sonrasında, 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü ve santrifüj içine bir doku kültürü hücre kazıyıcı, aktarım kullanarak olgun ve flor-etiketli DC hasat500, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca x g. </li><li> Herhangi bir artık parçacıklar ve ölü hücreleri yıkayın için, poli-L-lisin yemekleri uymak hasat hücreleri bırakın. Bu adım için hazırlamak için, 1 saat boyunca 37 ° C &#39;de poli-L-lisin (1 mg ml-1) ile kaplama Petri kapları daha sonra PBS ile ilişkisiz bir poli-L-lisin yıkayın. </li><li> Serumsuz ortam içinde poli-L-lisin-kaplanmış plakalar üzerinde toplanan hücreler üzerinde inkübe edin ve (1 saat 37 ° C,% 5 CO2) hücreleri uymak için izin verir. </li><li> Yapışmayan hücreler, kalan parçacıklar ve ölü hücreleri atmak ve üç kez yıkamak için orta yıkayınız önceden ısıtılmış (37 ° C) PBS. </li><li> Tripsin-EDTA ile muamele (% 0.25 tripsin-EDTA, 37 ° C &#39;de 3 dakika inkübasyon) ile hasat yapışan hücreler. </li><li> Başka bir yıkama santrifüj işleminin ardından, serumsuz steril PBS içinde olgun DC gerekli miktarda süspansiyon haline getirin. </li><li> Hücreler başarılı bir şekilde etiketli olup olmadığını belirlemek için, bu physicoche kontrol etmek için tavsiye edilirakış sitometrisi (FACS) kullanılarak hücrelerin mical karakteristikleri. Daha önce tarif edildiği gibi 11 yana doğru dağılım (SSC), bu hücreler artan bir parçalı yapı ortaya koymalıdır. Ayrıca fibroblast DC kültür kontamine olabilir ve aynı zamanda paralel olarak 19 F parçacıkları kadar sürebilir akılda tutulmalıdır. Bu nedenle DC saflık in vivo uygulama öncesinde (FACS kullanılarak CD11c + CD11b + hücrelerinin yüzdesi ölçülerek) değerlendirilmelidir. </li></ol> 3.. 19 F-etiketli Dendritik hücrelerin in vivo Uygulamada <ol><li> Bir tutucu içinde fare konumlandırarak intrakutanöz bir C57BL / 6 fare arka ayakları içine 100 ul ve dikkatli bir şekilde cildin üst katmanlarına bir 26 G iğne yarım ekleme - 50 arasında bir hacmi - DC (10 7 10 6) yönetme Uygulamadan önce (sürekli bağlı iğne ile kullanım 0.5 ml tüberkülin şırınga ölü hacmi en aza indirmek için). Bir sağlamak içinN uygun tırnak içi uygulama, bu iğne takılı kısmı deri altında kısmen görülebilir olması önemlidir. İğne daha fazla görünür değilse, iğnenin deri tabakaları içine çok derin eklenmiştir. Eğitimsiz birey için, intrakutan uygulama anestezi altında olabilir. </li><li> In vivo flor yılında tarafından görüntü bacaklarda (19 F) / proton (1 H) MR (sonraki bölüme bakın) 21 saat aşağıdaki enjeksiyon. </li></ol> 4. In Vivo 19 F / 1 H Manyetik Rezonans Görüntüleme MR taramaları kurmak için ayrıntılı talimatlar kontrol yazılımı Paravison (sürüm 5.1) kullanarak bir Bruker MR tarayıcı bakın. Satıcıya özgü fonksiyonları ve öğeleri atıfta isimleri italik olarak vurgulanmıştır. Diğer MR tarayıcılar için şu adımları üreticilerin kurallarına göre ayarlanması gerekebilir. <ol><li> Özel bir erişim düzenlemekküçük hayvan MR tarayıcı. Hızlı Biomed, Würzburg,; yeterli görüntü kalitesi, 9,4 Tesla veya daha fazla ve özel radyo frekans bobinleri (örneğin 1 H / 19 F çift ayarlanabilir ses RF bobin, 35 mm iç çapı, 50 mm uzunlukta bir manyetik alan şiddeti ile bir sistem için Almanya) tavsiye edilir. </li><li> MRG öncesinde, anestezi ve fizyolojik izleme için MR tarayıcı kurulumu hazırlamak. Hayvan yatak / sahibinin solunum maskesi izofluran sistemine bağlı ve sıcaklık probu ve nefes ped uzak bir hayvan izleme sistemi (örneğin Model 1025, SA Instruments Inc, New York, ABD) bağlı olduğundan emin olun. İkincisi, vücut ısısı ve solunum gibi hayvanın yaşamsal parametreleri izlemek için hizmet vermektedir. </li><li> Bir izofluran sistemine bağlı bir fare odası kullanarak Teneffüs narkoz ile fareler anestezi. 0.2 L dk -1 ve 0,1 L dk -1, sırasıyla hava ve O 2 için akış hızı ayarlayınve anestezi gerekli seviyesine kadar yaklaşık 2 dakika izofluran% 3 (bir buharlaştırıcı arasında ayarlanabilir) (cevap aşağıdaki ayak tutam) ulaşılır. Optimal debilerde kullanılan kurulum bağlı olarak değişebilir. Yüksek akış oranları aşırı su kaybına yol olabileceğini unutmayın. Yukarıda da belirtildiği gibi hayvanların koşulları dikkatli izleme her zaman gereklidir. </li><li> Küçük hayvan MR tarayıcı (Şekil 1) fare yatak / tutucu eğilimli fare yerleştirin. </li><li> Hava ve O 2 Sabit için akış hızı tutarken, 0.8 izofluran buharlaştırıcı ayarlamak -% 1.5 optimal solunum paterni ulaşılana kadar. 50 bir solunum hızı - dakika başına 70 nefes önerilir. </li><li> Sıcak su (ya da alternatif olarak sıcak hava), dolaşım sistemi kullanılarak, deney sırasında 36-37 ° C &#39;de vücut sıcaklığı tutmak. </li><li> Ölçüm sırasında steril göz yağlama merhemi ile fare nemli gözünde tutun. </li><li> Hayvan güvence sonraGörüntüleme tutucu ve izleme sistemine bağlantıları, 1 H / 19 F RF bobini (hayvan tarayıcı mıknatısın İzomerkez konumlandırılmış olduğu) ortasına sahibinin hareket ettirin. </li><li> Otomatik bir yöntem (örneğin motorlu hayvan sahibi ile birlikte bir konumlandırma lazer kullanarak) veya manuel olarak tutucu hareket gereken mesafe hesaplayarak ya, diz mıknatısın İzomerkez içinde yatıyor böyle fare konumunu ayarlamak cazibe merkezi haline İzomerkez ulaşmak için. </li><li> Tarayıcı hayvanın doğru konumlandırma teyit ve daha sonra görüntü dilim geometrisi (uzayda yani boyutu, konumu ve dönme) planlanması için, hızlı ve düşük çözünürlüklü görüntü kullanılarak üç standart yönelimleri (sagital, koronal, eksenel) görüntüleri keşif elde elde etme yöntemleri (bir FLASH darbe dizisi kullanır örneğin TriPilot protokolü,). </li><li> 1 H rezonans frekansına RF bobini ayarlayın (örneğin. 400.1 9.4 T MHz) ve 19 F rezonans frekansı ile (örneğin, 9.4 T 376.3 MHz) ve hayvan MR tarayıcı arasında ayarlama monitörü kullanarak 50 Ohm bobinin karakteristik empedansı eşleşir. Tuning ve eşleştirme iletim ve sinyal alımı için en uygun koşulları elde etmek için gereklidir. </li><li> RF genlik (ayarlamak için fare Lamor frekansı (örneğin ADJ_SF) ve referans kazanç için RF ayarlamak için ince ayar için manyetik alan (örneğin ADJ_SHIM), sistem frekans ayarlamaları homojenliği layneri dahil olmak üzere gerekli otomatik sistem ayarlarını yapın örneğin ADJ_REFG). Tüm bu ayarlar mümkün olduğu kadar homojen olarak ilgi bölgesinde sabit ve değişken alanları manyetikleri (B 0, B 1) yapmak için önemlidir. </li><li> Görüş alanı (FOV) öyle ki alt ekstremite hem ar ayarlanabilir sonra, üç ortogonal yönelimleri birlikte izci görüntüleri ikinci bir set (yukarıdaki gibi) eldepelvis yürüyerek (UxGxY = 50x25x25 mm) görülebilir e. Bu görüntüler son 3D 1H / 19 F taramalarının yönelimleri planı için hizmet vermektedir. </li><li> TR / TE = 1500/53 msn, FOV = 50x25x25 mm, Matrix = 400x200x200, NADİR Faktörü = 16 (. Tarama süresi yaklaşık 60 dakika): 1 H-tarama için bir TurboRARE 3D protokol ayarlayın. Izci görüntülerin yardımıyla FOV ayarlayın, (trafik ışığı) taramayı başlatın. </li><li> En az 1000 milisaniye bir TR ile bir tek darbe FID-dizisi yükleyin. Düzenleme Tarama açın ve 19 F. çekirdek set Toolbox Düzen Yöntem otomatik referans kazanç seçimini kaldırarak manuel kazanç ayarları kullanın. </li><li> GSP (kurulum gidin) kullanarak gerçek zamanlı olarak bir MR sinyalini görüntülemek için kayıt veri olmadan ölçümü başlatın. Satın alma penceresi içinde 19 F spektral sinyal çok düşükse, Düzen Yöntemi ve / daha ortalamaları eklemek veya si kadar darbe zayıflatıcı (Tx 0 veya SP0 kaydırıcı) modülegnal açıkça görülebilir. Satın alma penceresinde 0 Hz&#39;de 19 F spektral tepe merkezi için temel frekans ayarlayın. Temel frekans ve basın Dur uygulayın. Anestezi olarak kullanılan izofluran bir arka plan sinyal oluşturabilir unutmayın. 9.4 Tesla MR az 19 F-ihtiva eden parçacıklar ve izofluran arasındaki kimyasal kayma 1800 Hz ile ilgilidir. Uyarma bant genişliği 19 F-etiketli hücreleri veya partikülleri ile heyecan verici izofluran birlikte önlemek için 3.600 Hz daha küçük olduğundan emin olun. Temel frekans 19 F-etiketli hücreleri tarafından üretilen sinyal doğru ayarlanmalıdır. Deneyci uygun gördüğü Alternatif olarak, anestezi başka bir yöntem kullanılabilir. </li><li> Clone (yinelenen) bir önceki 1H tarama TurboRARE 3D protokolü. Yöntem ve seçimini kaldırın otomatik referans kazanç (yukarıdaki gibi) Edit. Düzen Tarama 19 F çekirdek ayarlayın. 128x64x64 için değiştirme matrisive en az 40 (64 kadar) için NADİR-Faktör. Bir TR / TE 1000/6 msn ve 64 ortalamaları için, tarama süresi yaklaşık 70 dk. 101 (araç) için alıcı kazanç ayarlayın ve GOP (boru hattı gidin) kullanarak herhangi bir başka ayarlamalar olmadan taramayı başlatın. </li><li> Taramaları bittiğinde MR tarayıcıdan fare tutucu geri çekin. Dikkatle sahibinden fareyi çıkarın. Fareyi ex vivo analizi (örneğin histoloji veya spektroskopisi, aşağıya bakınız) için kurban değilse tamamen anestezi kurtarıldı kadar doğrudan MR ölçümleri sonra, yakından takip. Vücut ısısı düzenleme anestezi etkilenir, bu nedenle kurtarma işlemi sırasında, bir sıcak sıcaklık ayarlı ped yerleştirilen ayrı bir kafes içinde fare koymak. Fareyi tamamen anestezi kurtarıldı sonra, onun tutma kafesine ve hayvan odasına geri. </li><li> 19 F görüntüleri 1H görüntülere kaplamak için, Görünüm Menüsü o kullanınaynı yazılım (Paravison) üzerinde ption. Underlay fonksiyonu Correlate altında bulunabilir. , Altlık yeni resim yüklemek ve tablo, bak yeni bir renk tanımlayarak 19 F katmanı vurgulayın. 19 F ve 1 H taramaları arasında ayrımcılık için, 19 F sinyali seçilen renk ve arka plan 1H görüntü olacak şekilde gri kalır (kesim tablo Look up) seçilen renk için eşik değiştirmek. Başka bir işlem sonrası programları (örneğin ImageJ) 1 H / 19 F görüntü bindirmeleri oluşturmak için kullanılabilir. </li><li> 19 F sinyal in vivo ölçümü bir gerekli olmalı, daha önce 15,16 açıklandığı gibi basit bir nicel protokol izleyin. Kısacası, miktar fare yanındaki FOV içinde PFCE-Emülsiyon, bilinen bir konsantrasyon ile bir referans tüpü yerleştirerek yapılabilir. MR görüntüleri, Quan aldıktan sonrabölge arasında çıkar (ROI) analizi kullanılarak 19 F sinyallerin şiddetleri tify ve Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, in vitro kalibrasyon eğrisi ile karşılaştırın. </li></ol> 5. Lenf nodu Manyetik Rezonans Spektroskopisi (MRS) <ol><li> Fare kurban ettikten sonra, küçük bir 5 mm NMR tüpü içine popliteal lenf düğümü ve yer çıkarın ve% 2 PFA 100 ul ekleyin. </li><li> Lenf nodu içeren NMR tüpü tutmak için en az 5 mm&#39;lik bir açıklık vardır bir 19 F spektroskopi bobin (bir toroidal bobin gibi) yükleyin. </li><li> Bobin içindeki NMR tüpü yerleştirin ve mıknatısın İzomerkez içine bobin hareket ettirin. </li><li> 19 F rezonans frekansı (örneğin 9.4 T 376,3 MHz) için RF bobin ayarlamak ve hayvan MR tarayıcının ayar monitör kullanarak 50 Ohm için bobin karakteristik empedansı maç. Tuning ve eşleştirme iletim ve sinyal için en iyi koşulları elde etmek için gereklidiralımı. </li><li> 0 Şimleme Araç içindeki tüm dolgu parametrelerini ayarlamak ve uygulamak basın. Genellikle, bu numune hacmi nispeten küçük olduğu için layneri yöntemleri uygulamak için gerekli değildir. Yeterli 19 F sinyali varsa, otomatik yöntemler layneri, sistem frekans ve yukarıda açıklandığı gibi alıcı kazanç için uygulanabilir. </li><li> En az 1000 milisaniye bir TR ile tek bir darbe FID dizisi yükleyin. Tarama Düzenleme ve 19 F. çekirdeğin ayarlamak açın Toolbox Düzen Yöntem otomatik referans kazanç seçimini kaldırarak manuel kazanç ayarları kullanın. 1 ortalama sayısını ayarlayın. </li><li> GSP kullanarak dizisi başlatın. Satın alma penceresi içinde 19 F spektral sinyal çok düşükse, Düzen Yöntemi ve / daha ortalamaları eklemek veya bir sinyal kadar darbe zayıflatıcı (Tx 0 veya SP0 kaydırıcı) açıkça görülebilir modüle. Temel frekans ayarlama, böylece 19 F SPEctral pik 0 Hz elde etme penceresinin merkezinde ve temel frekans geçerlidir. 90 ° uyarma ulaşmak için sinyal, en üst düzeye çıkarmak için tekrar nabız zayıflatıcı ayarlayın. Sinyal maksimum basın Durdur olduğu zaman. </li><li> 64 ve 256 arasında Düzen yöntemi (ya da daha fazla gerekirse, sinyal bağlı olarak) ortalamaları ayarlayın ve GOP kullanarak satın alma başlar. Saptanan sinyal ortalama sayısı ile doğrusal ilişkilidir. Ölçümü sırasında Saptanan sinyal bir ortalama normalize gerektiğini unutmayın. Ayrıca, bilinen bir konsantrasyonda bir kalibrasyon eğrisi veya bir kalibrasyon standardı normalize 19 F sinyali (Şekil 2) hücrelerin sayısını hesaplamak için gereklidir. </li><li> Tarama tamamlandıktan sonra, örnek kaldırmak bir sonraki örnek yerleştirin ve adım 5.3 ile devam edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Yeh, T. C., Zhang, W., Ildstad, S. T., Ho, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamic+MRI+tracking+of+rat+T-cells+labeled+with+superparamagnetic+iron-oxide+particles.">In vivo dynamic MRI tracking of rat T-cells labeled with superparamagnetic iron-oxide particles.</a> Magn. Reson. Med. 33 (2), 200-208 (1995).</li><li>Weissleder, R., Cheng, H. C., Bogdanova, A., Bogdanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetically+labeled+cells+can+be+detected+by+MR+imaging.">Magnetically labeled cells can be detected by MR imaging.</a> J. Magn. Reson. Imaging. 7 (1), 258-263 (1997).</li><li>Franklin, R. J., Blaschuk, K. L., Bearchell, M. C., Prestoz, L. L., Setzu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+imaging+of+transplanted+oligodendrocyte+precursors+in+the+rat+brain.">Magnetic resonance imaging of transplanted oligodendrocyte precursors in the rat brain.</a> NeuroReport. 10 (18), 3961-3965 (1999).</li><li>de Vries, I. J., Lesterhuis, W. J., Barentsz, J. O., Verdijk, P., van Krieken, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+tracking+of+dendritic+cells+in+melanoma+patients+for+monitoring+of+cellular+therapy.">Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy.</a> Nat. Biotechnol. 23 (11), 1407-1413 (2005).</li><li>Liu, W., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+magnetically+labeled+cells+by+cellular+MRI.">Detection and quantification of magnetically labeled cells by cellular MRI.</a> Eur. J. Radiol. 70 (2), 258-264 (2009).</li><li>Ahrens, E. T., Flores, R., Xu, H., Morel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+platform+for+tracking+immunotherapeutic+cells.">In vivo imaging platform for tracking immunotherapeutic cells.</a> Nat. Biotechnol. 23 (8), 983-987 (2005).</li><li>Holland, G. N., Bottomley, P. A., Hinshaw, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-19+Magnetic-Resonance+Imaging.">F-19 Magnetic-Resonance Imaging.</a> Journal of Magnetic Resonance. 28 (1), 133-136 (1977).</li><li>Partlow, K. C., Chen, J., Brant, J. A., Neubauer, A. M., Meyerrose, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=19F+magnetic+resonance+imaging+for+stem/progenitor+cell+tracking+with+multiple+unique+perfluorocarbon+nanobeacons.">19F magnetic resonance imaging for stem/progenitor cell tracking with multiple unique perfluorocarbon nanobeacons.</a> FASEB J. 21 (8), 1647-1654 (2007).</li><li>Ruiz-Cabello, J., Walczak, P., Kedziorek, D. A., Chacko, V. P., Schmieder, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+"hot+spot"+MR+imaging+of+neural+stem+cells+using+fluorinated+nanoparticles.">In vivo "hot spot" MR imaging of neural stem cells using fluorinated nanoparticles.</a> Magn. Reson. Med. 60 (6), 1506-1511 (2008).</li><li>Srinivas, M., Morel, P. A., Ernst, L. A., Laidlaw, D. H., Ahrens, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorine-19+MRI+for+visualization+and+quantification+of+cell+migration+in+a+diabetes+model.">Fluorine-19 MRI for visualization and quantification of cell migration in a diabetes model.</a> Magn. Reson. Med. 58 (4), 725-734 (2007).</li><li>Waiczies, H., Lepore, S., Janitzek, N., Hagen, U., Seifert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorocarbon+particle+size+influences+magnetic+resonance+signal+and+immunological+properties+of+dendritic+cells.">Perfluorocarbon particle size influences magnetic resonance signal and immunological properties of dendritic cells.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21981 (2011).</li><li>Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Bone+Marrow+Derived+Murine+Dendritic+Cells+for+Use+in+2-photon+Imaging.">Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging.</a> J. Vis. Exp. (17), e773 (2008).</li><li>Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li><li>Lanzavecchia, A., Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ralph+M.+Steinman.+1943-2011.">Ralph M. Steinman. 1943-2011.</a> Cell. 147 (6), 1216-1217 (1943).</li><li>Srinivas, M., Turner, M. S., Janjic, J. M., Morel, P. A., Laidlaw, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cytometry+of+antigen-specific+t+cells+using+19F.">In vivo cytometry of antigen-specific t cells using 19F.</a> MRI. Magn. Reson. Med. 62 (3), 747-753 (2009).</li><li>Srinivas, M., Heerschap, A., Ahrens, E. T., Figdor, C. G., de Vries, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(19)F+MRI+for+quantitative+in+vivo+cell+tracking.">(19)F MRI for quantitative in vivo cell tracking.</a> Trends Biotechnol. 28 (7), 363-370 (2010).</li><li>Lammermann, T., Bader, B. L., Monkley, S. J., Worbs, T., Wedlich-Soldner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Liu, M. S., Long, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluoroctylbromide+as+a+diagnostic+contrast+medium+in+gastroenterography.">Perfluoroctylbromide as a diagnostic contrast medium in gastroenterography.</a> Radiology. 122 (1), 71-76 (1977).</li><li>Kwiatkowska, K., Sobota, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+phagocytosis.">Signaling pathways in phagocytosis.</a> Bioessays. 21 (5), 422-431 (1999).</li><li>Mitragotri, S., Lahann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+approaches+to+biomaterial+design.">Physical approaches to biomaterial design.</a> Nat. Mater. 8 (1), 15-23 (2009).</li><li>Hoult, D. I., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signal-to-noise+ratio+of+the+nuclear+magnetic+resonance+experiment.">The signal-to-noise ratio of the nuclear magnetic resonance experiment.</a> J. Magn. Reson. 24 (1), 71-85 (1976).</li><li>Kovacs, H., Moskau, D., Spraul, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryogenically+cooled+probes+-+a+leap+in+NMR+technology.">Cryogenically cooled probes - a leap in NMR technology.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 46 (2-3), 131-155 (2005).</li><li>Waiczies, H., Millward, J. M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Cellular+Infiltrates+during+Early+Stages+of+Brain+Inflammation+with+Magnetic+Resonance+Microscopy.">Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy.</a> PLoS ONE. 7 (3), e32796 (2012).</li><li>Haacke, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design. , (1999).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

19 F / 1 H MRI lenf nodu içine DC hareketini takip etmek istihdam Bu yöntem in vivo bağışıklık hücrelerinin göç yollarını incelemek için fırsat verir. Dendritik hücreler hızla sıkı belirli yüzeylere 17 kalarak olmadan üç boyutlu yapılar aracılığıyla manevra edebiliyoruz bağışıklık hücrelerinin göç mükemmel örnekleridir. Tanımlanan teknik uzaysal çözünürlüğü (mikron aralığında) bu teknikle, multiphoton mikroskobu ile elde edilebilen ...

In vivo hücre izleme biyomedikal pek çok alanda çok önemli bir yönüdür. Bunun için, seçici olarak bir süre içinde hücre lokalize edilebilir non-invazif görüntüleme yöntemleri son derece değerlidir. Üç boyutlu manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gelişimine önce, bağışıklık hücre göç izleme mikroskopik analizler veya doku biyopsisi ile sınırlıydı. MR yardımıyla hücre izleme in vivo immün hücre davranışlarını incelemek Bağışıklık için değil sadece, son yıllarda büyük önem kazanmıştır, ama aynı zamanda klinik ve kök hücre araştırmacılar için vardır. 90&#39;lı yılların sırasında, demir oksit ilk çalışmalar 1 MR ile izleme hücreler için gelişmelerin bir çağlayan başlattı nanopartiküller. Demir oksit parçacıkları işaretli hücrelerin MR gevşeme zamanı (T2 *) kısaltmak ve böylece MR görüntülerde sinyal azalması neden olur. Demir oksit parçacıkları etiketi makrofajlar 2, oligodendrosit s istihdam edilmiştirrogenitors 3 ve bir çok diğer hücre türleri. Bu parçacıkların bazıları da klinik olarak melanom hastalarında 4 hücresel aşılar etiketleme için FDA tarafından onaylanmıştır. In vivo veya demir oksit parçacıkları ile hücrelerin ex vivo etiketleme yana T2 * sinyalinin bir kısalma dayanır ve ikincisi de, bu tür mikro kanamaları, demir yatakları veya hava kabarcıkları gibi in vivo duyarlılık ile ilgili T2 * etkileri getirdiği olabilir diğer arka plan in vivo T2 * sinyal yok oluşların 5 etiketli hücreleri tanımlamak için zor olabilir. Bu yazıda, 19 F / 1 H manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kullanılarak in vivo dendritik hücreler (DC) izlemek için bir teknik tarif. Bu hücre izleme teknolojisi sadece MR 19 F için ilk tanınan uygulamaları 7. Min olmuştu birkaç yıl sonra 2005 6 yılında tanıtıldı. Önemli bir Advademir oksit parçacık hücre etiketleme üzerinde 19 F ntage dokusunda 19 F düşük biyolojik olay, bu temelde arka plan olmayan görüntüler ile çok seçici hücreleri izlemek için mümkün kılar. Ayrıca, geleneksel 1H MR elde edilen anatomik görüntüleri ile nakledilen etiketlenmiş hücrelerden 19 F MR sinyali kaplamak mümkündür. 19 K / 1 H MR nedenle, in vivo hücre göçü araştıran çalışmaları için oldukça uygundur. Bu yöntem ile çalıştı Hücreler 19 F-zengin parçacıkları ile etiketlenir. Öncelikle karbon ve florin atomu oluşan sentetik olarak türetilmiş perflorokarbonlar (PFC) genellikle parçacıkları hazırlamak için kullanılır. Bu bileşikler, su içinde çözünmez ve in vitro veya in vivo uygulama öncesinde emülsiyondan geçirilmesine gereksinim vardır. F-MR izleme deneylerde in vivo 19 için diğer gruplar tarafından istihdam edilmiştir PFC parçacıkların boyutu normalde100 nm ve 245 nm 6,8-10 arasında değişmektedir. Ancak biz göstermiştir ki, artan parçacık boyutu (&gt; 560 nm) perfloro-15-taç eter-5-(PFCE) partiküllerinin artışları ile dendritik hücrelerin etiketleme verim. 11

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C57BL/6 mice</td>
 <td>Charles River, Berlin</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>21875-091</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS Superior</td>
 <td>Biochrom AG</td>
 <td>S 0615</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Gibco-Invitrogen</td>
 <td>15630-056</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>15140-122</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25030-024</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>D8662</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFA</td>
 <td>Santa Cruz</td>
 <td>sc-281692</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfluoro-15-crown-5-ether </td>
 <td>ChemPur</td>
 <td>391-1996</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pluronic F-68 </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P5556</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes (35 x 10 mm)</td>
 <td>VWR, Germany</td>
 <td>391-1996</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>27 &frac12; G syringes</td>
 <td>VWR, Germany</td>
 <td>612-0151</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon cell strainers (100 &mu;m mesh) </td>
 <td>VWR, Germany</td>
 <td>734-0004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NMR tubes </td>
 <td>VWR, Germany</td>
 <td>634-0461</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection tools</td>
 <td>FST</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CO2 incubator </td>
 <td>Binder</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small animal MR system</td>
 <td>Bruker Biospin</td>
 <td></td>
 <td>9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1H/19F dual-tunable volume RF coil </td>
 <td>Rapid Biomed, W&uuml;rzburg, Germany</td>
 <td></td>
 <td>35 mm inner diameter, 50 mm length</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>19F spectroscopy coil </td>
 <td>in-house</td>
 <td></td>
 <td>tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isoflurane inhalation system</td>
 <td>F&ouml;hr Medical Instruments GmbH</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Animal monitoring system Model 1025</td>
 <td>SA Instruments Inc., New York, USA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

monitoring dendritic cell migration using 19f / 1h magnetic resonance imaging

Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gibi girişimsel olmayan görüntüleme yöntemleri sürekli gelişmeler büyük ölçüde canlılar fizyolojik veya patolojik süreçler çalışma yeteneğimizi geliştirdik. MR da in vivo olarak nakledilen hücrelerin yakalamak için değerli bir araç olduğunu gösteriyor. MR rahatlama kez etkileyen kontrast maddelerin MRG yapılan kullanımı için ilk hücre etiketleme stratejileri (T1, T2, T2 *) ve etiketli hücreleri mevcut sinyalinin bir donanım (T1) veya tükenmesi (T2 *) yol açar. T2 gibi ultrasmall demir oksit ajanlar (USPIO) olarak * geliştirme ajanlar hücre göçü ve bazıları da klinik uygulama için FDA tarafından onaylanmış çalışma istihdam edilmiştir. T2 * ajanların bir dezavantajı, kan pıhtılaşması, mikro kanamaları veya hava kabarcıkları gibi diğer eserler etiketli hücreler tarafından oluşturulan sinyal yok ayırt etmek zor olmasıdır. Bu yazıda, in vivo izleme hücreler için gelişmekte olan bir teknik tarifflorin (19 F) zengin parçacıkları ile hücrelerin etiketlenmesi dayanmaktadır. Bu parçacıklar perflorokarbon (PFC) bileşikleri emülsifiye edici ve daha sonra daha sonra MR 19 F tarafından görüntülenebilir etiket hücreleri, için kullanılır tarafından hazırlanır. In vivo içerir (i), daha sonra 19 F rezonans spektroskopi ile de hücreye sinyal ölçmek için arka plan görüntüleri içermeyen ve tam hücre selectivityand (ii) olasılığı elde edilir, in vivo olarak bağlı karbon-19 K, yokluğunda hücre izleme için PFC önemli avantajlar .

Intrakutanöz uygulamasını takiben on sekiz yirmi bir saat, 19 F-etiketli dendritik hücreler (DC) drenaj popliteal lenf nodu göç. Boşaltma politeal lenf nodu içine lenf kanalları üzerinden DC hareketi 19 F DC görüntüleri (Şekil 2A) ile 1 H anatomik görüntüleri kaplanacağı tarafından takdir edilebilir. Daha önce in vivo olarak, bu hücrelerin göç, hem de alım verimi 11 dahil DC Immunobiology, 19 F-parçacık boyutunun ...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging at JoVE.com

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

MRI kullanarak hücrelerin Takip geçmiş yıllarda kayda değer bir ilgi kazanmıştır. Bu protokol, flor ile dendritik hücrelerin etiketlenmesi açıklanmaktadır (<sup&gt; 19</sup&gt; F) zengin bu hücrelerin in vivo uygulama parçacıklar, ve ile drenaj lenf nodu göç ölçüde izlenmesi<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H MR ve<sup&gt; 19</sup&gt; F MRS.

Kullanarak İzleme Dendritik Hücre Göç<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Manyetik Rezonans Görüntüleme

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

monitoring-dendritic-cell-migration-using-19f-1h-magnetic-resonance

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

11.7K Görüntüleme.  A joint cooperation between the Charité Medical Faculty and the Max Delbrück Center for Molecular Medicine. MRI kullanarak hücrelerin Takip geçmiş yıllarda kayda değer bir ilgi kazanmıştır. Bu protokol, flor ile dendritik hücrelerin etiketlenmesi açıklanmaktadır ( 19 F) zengin bu hücrelerin in vivo uygulama parçacıklar, ve ile drenaj lenf nodu göç ölçüde izlenmesi 19 F / 1 H MR ve 19 F MRS.

Video: Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

Lökotrien B Gerçek zamanlı görüntüleme 4 Hücre aracılığı ile Göç ve β-arrestin BLT1 Etkileşimleri

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial cells and tissue extravasation is a multistep process controlled by different adhesion molecules (homing receptors) expressed on lymphocytes and their respective ligands (addressins) displayed on endothelial cells 1 2. Even though the function of these adhesion receptors can be partially studied ex vivo, the ultimate test for their physiological relevance is to assess their role during in vivo lymphocyte adhesion and migration. Two complementary strategies have been used for this purpose: intravital microscopy (IVM) and homing experiments. Although IVM has been essential to define the precise contribution of specific adhesion receptors during the adhesion cascade in real time and in different tissues, IVM is time consuming and labor intensive, it often requires the development of sophisticated surgical techniques, it needs prior isolation of homogeneous cell populations and it permits the analysis of only one tissue/organ at any given time. By contrast, competitive homing experiments allow the direct and simultaneous comparison in the migration of two (or even more) cell subsets in the same mouse and they also permit the analysis of many tissues and of a high number of cells in the same experiment.
Here we describe the classical competitive homing protocol used to determine the advantage/disadvantage of a given cell type to home to specific tissues as compared to a control cell population. We chose to illustrate the migratory properties of gut-tropic versus non gut-tropic T cells, because the intestinal mucosa is the largest body surface in contact with the external environment and it is also the extra-lymphoid tissue with the best-defined migratory requirements. Moreover, recent work has determined that the vitamin A metabolite all-trans retinoic acid (RA) is the main molecular mechanism responsible for inducing gut-specific adhesion receptors (integrin a4b7and chemokine receptor CCR9) on lymphocytes. Thus, we can readily generate large numbers of gut-tropic and non gut-tropic lymphocytes ex vivoby activating T cells in the presence or absence of RA, respectively, which can be finally used in the competitive homing experiments described here.

Competitive homing experiments allow to directly assessing the migratory properties of two different cell populations in a single mouse. Here we illustrate this procedure by comparing the migration of ex vivo-generated gut-tropic versus non-gut tropic T cells.

Gut-tropik T Hücre Göç Eğitim Rekabetçi Homing Tahliller

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Hücre olgunlaşması olmadan Dendritik Hücreler Verimli Transfeksiyon için optimize edilmiş Protokolü

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Numune Hazırlama<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</emNükleer Manyetik Rezonans metabolomik Araştırmaları&gt; özler

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

Alerjik Havayolu Enflamasyon sırasındaki solunum Dendritik Hücre olgunlaşması ve Göç Analizi

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

Melanom ve Skuamöz Kanser Kök Hücreleri Kullanılarak Yeni Bir Dendritik Hücre aşısının Üretilmesi

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with &lt;em&gt;Mycobacterium bovis&lt;/em&gt; Bacille Calmette-Gu&amp;#233;rin

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

ile Enfeksiyon sırasında boşaltılması Lenf düğümleri içine Fare Cilt Dendritik Hücre Göç Eğitim Bir KAKE tabanlı Testi<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Basil Calmette-Guerin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...