Bu protokol, işlevsel, kapsamlı olmayan, bellek benzeri NK hücrelerinin genişlemesini, genişleme sistemine dayanan diğer besleyici hücrelere kıyasla ex vivo olarak önemli ölçüde artırabilir. Bu, NK hücresi genişlemesinden önce NK hücre izolasyon adımını atladığımız besleyici hücreleri kullanan diğer protokollere kıyasla daha basit bir yöntemdir. Bu protokol, immünoterapi için yeterli sayıda NK hücresi ve CAR-NK sağlayabilir.
Bu teknik oldukça tekrarlanabilir. Bununla birlikte, taze, yeni başlangıç malzemeleri kullanmak ve genişlemenin ilk birkaç günü boyunca NK hücrelerini rahatsız etmemeye dikkat etmek çok önemlidir. Lenfositler elde etmek için steril cerrahi ekipman kullanarak canlı doku alanlarını tanımlayarak ve kesitleyerek başlayın.
Daha sonra, kesitli dokuları kalsiyum veya magnezyum olmadan 30 mililitre HBSS'ye yerleştirin ve dokuyu izolasyona hazır olana kadar buz üzerinde tutun. Bir biyogüvenlik kabini içinde çalışırken, dokuyu steril tıraş bıçakları ve forseps ile 0,5 santimetreden daha az küplere kesin. Kıyılmış doku parçalarını, en fazla 4 gram, doku ayrışma tüplerine yerleştirin ve doku parçalarına 10 mililitre kollajenaz IV ekleyin.
Dokuyu iyice kıymak için, doku ayrışma tüplerini 37 santigrat derecede bir doku ayrıştırıcıya uygulayın. Tüpleri doku ayrıştırıcısından çıkardıktan sonra, kıyılmış dokuyu 5 mililitrelik bir şırınganın arka ucunu kullanarak 40 mikronluk bir naylon hücre süzgecinden tritüre edin. Büyük sindirilmemiş parçaları atın.
Toplanan elüenti oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400G'de döndürün ve yağ hücrelerini çıkarmak için hücre peletlerini% 30 polivinilpirolidon kaplı silika içinde yeniden askıya almadan önce süpernatantı aspire edin. Hücre peletini 9 mililitre R-10 ortamında yeniden askıya almadan önce hücreleri tarif edildiği gibi döndürün. Lenfositleri kırmızı kan hücrelerinden ve polimorfonükleer hücrelerden ayırmak için, hücre süspansiyonunu 4 mililitre Ficoll veya lenfosit ayırma ortamı üzerine dikkatlice katlayın.
Hızlanma ve frenler kapalıyken oda sıcaklığında 23 dakika boyunca 400G'de santrifüj yaparak katmanları ayırın. Daha sonra, üst-orta tabakayı dikkatlice boşaltın ve dokuya sızan lenfositleri içeren interfazı toplayın. Hücreleri 10 mililitre ortamla durulayın ve analiz veya birincil doğal katil veya NK hücre genişletme protokolü için devam edin.
Periferik kan mononükleer hücrelerini veya PBMC'leri ve 100 gama ışınlanmış 221-mIL-21 hücresini, 10 mililitre R-10 ortamı ile 5 dakika boyunca 400G'de santrifüjleme yoluyla ayrı ayrı yıkayın. Santrifüjlemeden sonra, akış sitometrisi için 6. PBMC'lere 1 x 10 tasarruf edin ve 5 x 10'u 6. PBMC'lere 10 x 10 ila 6. 100 gama ışınlanmış 221-mIL-21 hücresine özel bir 6 delikli plakada karıştırın. Aynı 6 delikli plakaya insan interlökin-2 ve insan interlökin-15 ile desteklenmiş 30 mililitre R-10 ortamı ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin, ortamı her 3 ila 4 günde bir değiştirin.
Kuluçka sırasında, toplam periferik kan doğal katilini veya PBNK, hücre numarası canlılığını kaydedin ve NK hücresi genişleme hızını hesaplamak için her 3 ila 4 günde bir akış sitometrisi yapın. İşlem görmüş 100 milimetrelik plaka başına 11 mililitre D-10 ortamındaki 6. 293T hücrelerine 1,8 x 10 ekleyin ve 293T hücrelerini 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ile inkübe edin. 1.70 mililitrelik bir tüpte, indirgenmiş serum ortamının 470 mikrolitresini 30 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ile karıştırın.
Ayrı bir 1.70 mililitrelik tüpte, 500 mikrolitrelik son hacmi yapmak için azaltılmış serum ortamına SFG vektöründe 2.5 mikrogram pRDF plazmid, 3.75 mikrogram Pegpam3 plazmid ve 2.5 mikrogram CAR yapısı ekleyin. Tüpün içeriğini, daha önce damla damla bir şekilde hazırlanan 1.70 mililitrelik tüp ile karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dakikalık inkübasyondan sonra, karışımın 1 mililitresini tüpten 293T hücre plakasına damla damla bir şekilde ekleyin ve plakayı 48 ila 72 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat dereceye yerleştirin.
Retronektin proteinini PBS ile mililitre başına 50 ila 100 mikrogramlık son bir konsantrasyona kadar seyreltin. Seyreltilmiş retronektinin 500 mikrolitresini, işlenmemiş 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna ekleyin. Ardından, plakayı parafilm kullanarak kapatın ve plakayı gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, retronektin plakasını 2, 103G'de 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı atın. 24 delikli plakanın her bir kuyusunu 1 mililitre R-10 ortamı ile bloke ettikten sonra, plakayı 1 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Retrovirüs süpernatını toplamak için 0,45 mikronluk bir filtre kullanarak daha önce transfekte edilmiş 293T hücrelerini filtreleyin.
Aliquot 2 mililitre filtrelenmiş retrovirüs süpernatantı 24 kuyucuklu retronektin plakasının her bir kuyucuğuna. 24 kuyucuklu retronektin plakasını 2, 103G'de 2 saat boyunca 32 santigrat derecede önceden ısıtılmış bir santrifüje santrifüj yapın. Plakalar santrifüj edilirken, genişletilmiş PBNK hücrelerini 0. Gün'den toplayın ve Trypan Blue kullanarak hücreleri sayın.
Genişlemiş PBNK hücrelerini, mililitre başına 2.5 x 10 ila 5. ila 5. hücrelere 5. ila 5. hücreler konsantrasyonuna kadar interlökin-2 ve interlökin-15 ile desteklenmiş R-10 ortamı ile seyreltin. 24 kuyucuklu retronektin plakasının santrifüjlenmesinden sonra, retrovirüs süpernatantını her bir kuyucuktan kısmen aspire edin. Daha sonra, seyreltilmiş genişletilmiş PBNK hücrelerinin 2 mililitresini her bir kuyucuğa ekleyin.
Plakayı 37 santigrat derecede inkübe etmeden önce plakayı 600G'de 32 santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj edin, 48 ila 72 saat boyunca% 5 karbondioksit ile. Tüpü 5 dakika boyunca 400G'de santrifüj yapmak için hücreleri 24 delikli plakadan 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Peletin 1 mililitre R-10 ortamı ile yeniden askıya alınmasından sonra, askıya alınan hücreleri, interlökin-2 ve interlökin-15 ile desteklenmiş 30 mililitre R-10 ortamı içeren özel bir 6 delikli plakaya aktarın.
Özel 6 delikli plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksiti ferahlatıcı ortamlarla inkübe edin ve NK hücresi genişleme hızını her 3 ila 4 günde bir hesaplayın. 221-mIL-21 ile genişleyen PBNK hücrelerinin yaklaşık 5 x 10 ila 4. kıvrımlara genişlediği gösterilmiştir. Ve NK hücresi saflığı, 21 günlük genişleme boyunca yaklaşık% 85'te tutuldu.
Genişlemeden önce, 221-mIL-21 genişleme sisteminin sağlamlığı, PBMC'lerin anti-CD56 ve anti-CD3 için boyanmasıyla incelendi, bu da NK hücreleri için% 7.09'luk bir hücre saflığı ve yüksek oranda T hücreleri gösterdi. PBMC'lerin ve 221-mIL-21 kokültürünün 4. gününde, CAR-NK transdüksiyonundan önce NK saflığı kontrol edildi. Anti-CD56, anti-CD3 ve anti-insan-IgG için boyanan CAR-NK hücreleri, 7. günde yüksek bir NK hücre popülasyonu gösterdi ve yaklaşık% 70'lik yüksek bir CAR transdüksiyon etkinliği gözlendi.
18. günde, çeşitli alt gruplardaki CAR ekspresyonu akış sitometrisi ile kontrol edildi. NK hücre genişlemesini takiben, hücreler in-vitro fonksiyonel testler veya in-vivo deneyler için kullanılabilir. Araştırmacı bu protokolü, fonksiyonel NK eksikliği olan hastalar ve köpek gibi diğer türler için NK ve CAR-NK'yi genişletmek için kullanabilir.
