Bu protokol, belirli genomik operasyonla baş boyun kanseri modellerinin geliştirilmesini sağladı ve neoplazi sürecinde spesifik gen mutasyonlarının rolünü anlamamızı önemli ölçüde etkiledi. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücre hattının hemen hemen her organdan geliştirilme kolaylığıdır. Prosedürü gösteren Manu Prasad benim laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi olacak.
Altı haftalık erkek veya kadın B6 transgenik fare dil hasat için cerrahi makas kullanarak başlayın. Çok küçük parçalar halinde doku kıyma ve serum olmadan RPMI düz orta 4,5 mililitre içeren 15 mililitrelik tüp içine parçaları toplamak için bir neşter kullanın. Tüpün enzim karışımına 200 mikrolitre üçlü enzim karışımı ekleyin ve tüpün enzimasyonunu geliştirmek için her 10 dakikada bir 30 dakika boyunca numuneyi 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sonunda, PBS%5 FBS ile reaksiyonu durdurun ve hücreleri büyük doku parçalarından ayırmak için hücre süspansiyonunu 70 mikro metrelik bir örgü süzgeçten filtreleyin. Santrifüj ile hücreleri toplamak ve tam orta üç mililitre pelet yeniden askıya. Sonra 16 milimetrelik çanak başına tam orta üç mililitre hücreleri plaka.
Filtrenin üstünde tutulan hücre agregalarını ayrı bir 16 milimetrelik kültür yemeğine aktarın ve üç mililitre tam ortam ekleyin. Farklı hücre kolonileri oluşana kadar her iki yemeği de kuvözde saklayın. Kültür bir hafta sonra, mikroskobik fibroblast kontaminasyon varlığı için birincil hücre kültürleri incelemek, bir dakika için 37 santigrat derece 02% EDTA% 25 tripsin ile hücreleri tedavi ve herhangi bir fibroblastlar kaldırın.
Kültürün 10. gününde hücre süspansiyonu veya hücre agrega kültürlerinden hücreleri hasat etmek için 37 santigrat derecede 3ila beş dakika boyunca %02 EDTA'da %25 tripsin kullanın ve 6 kuyulu plakanın her kuyunun her kuyusu için iki mililitre orta daki iki kat 10 ile beşinci birincil hücreleri görürsünüz. Ertesi gün mililitre başına 12 viral genomun bir katı ile hücreleri aktarın ve 37 santigrat derecede 48 saat boyunca viral parçacık içeren ortamdaki hücreleri kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, iyi başına taze tam orta iki mililitre ile kültür supernatants değiştirin ve hücre kültürü kuluçka hücreleri dönmek.
Kültür genişleme iki hafta sonra, doğrulama ve in vivo tümörijenik deneyler için hücreleri tohum. AAV CAS9 vektörü kullanılarak, virüs mililitrebaşına 10 ila 12 viral genomun, gösterildiği gibi protokolü kullanarak primer meth hücrelerini tümörijenik haritalara verimli bir şekilde dönüştürdüğu tespit edilmiştir. Transduced hücreleri Express Cre, CAS9 ve Yeşil Floresan Protein.
NOD SCID farelerin dil, dudak ve deriiçine beş kez 10 transduced haritalar enjeksiyonu, tümörlerneden olmayan primer haritalar enjeksiyon aksine bu hayvanlarda tümör oluşumu ile sonuçlanır. Primer dil epitel hücrelerinin tümörijenik dönüşümü immünfloresans ve batı blotlama kullanılarak doğrulanabilir. Dönüştürülmüş hücrelerden izole edilen DNA'nın derin dizilemesi ile genomik analiz, AAV CAS9 sistemi tarafından tümör proteini 53 ve APC genlerinin etkili gen düzenlemesini ve çerçeve değişimini doğrular.
Buna ek olarak, dönüştürülmüş dil hücreleri verimli vahşi tip C57 siyah altı farelerde tümörler oluşturur. Neoplastik tümör hücrelerinin immünohistokimyasal analizi, her ikisi de epitel doku belirteçleri olan E-Kadherin ve Keratin 14'ün sitoplazmik ekspresyonunu ortaya koymaktadır. Bu yordamı denerken, her zaman çok fazla kıyma veya çok fazla enzimatik reaksiyon hücrelerin azaltılmış canlılık yol unutmayın, azaltılmış virüs işlem verimliliği yol açan.
Bu prosedürü kullanarak, hücre hatları genetik ilgi herhangi bir doku dan kanser hücrelerinin tümörijenik ve metastatik potansiyeli içine fikir kazanmak için değiştirilebilir.
