Bu protokol, karmaşık 3D biyobaskı deneylerinden önce hassas birincil ve bağışıklık hücrelerine karşı potansiyel sitotoksik etkiler için aday biyomalzeme mürekkeplerini taramak için kolay ve hızlı bir yaklaşım sunar. Biyomalzeme mürekkep yapılarındaki bağışıklık hücrelerinin inkübasyonundan sonra, hücreler aşağı akış sitotoksisitesi veya biyobelirteç analizleri yapmak için nazik yıkama ile yapılardan kolayca alınabilir. Bu protokol, transplantasyona yönelik biyobaskı dokularının birincil hücrelerden ve biyouyumlu biyomalzeme mürekkeplerden inşa edilmesi gereken doku mühendisliği ile doğrudan ilgilidir.
Başlamak için, INKREDIBLE+3D biyobaskı üzerine kurulum için bir biyo mürekkep kartuşu hazırlayın. İlk olarak, mavi uç kapaklarını üç mililitre biyomalzeme mürekkep kartuşundan çıkarın ve biyo mürekkep kartuşunun Luer kilit ucuna steril 22 kalibrelik konik biyobaskı nozulu yapıştırın. Yazıcı kafası bir veya PH1 için hava basıncı besleme borusunu kartuşun karşı ucuna bağlayın ve kartuşu bağlı konik biyobaskı nozülüyle PH1'in dikey yuvasına takın.
Ardından, kartuşu PH1'e baskı kafasının altına uzanan konik bir biyobaskı nozülü ile sıkıca oturtun. Biyo mürekkep kartuşunu yerine kilitlemek için PH1'deki vidayı parmak sıkışıncaya kadar saat yönünde sıkın. 3D biyobaskı PH2 boş bırakılarak gerçekleştirilebileceğini unutmayın.
Biyobaskıyı açın ve biyobaskı yazılımını BIR USB 2.0 kablosuyla 3D biyobaskıya bağlı bir pc'de başlatın. Yazılımda, 3D biyobaskı ile senkronize etmek için bağlan düğmesine tıklayın. 3D biyobaskı ana kontrol menüsünde üç seçeneğe uyun.
İlk olarak, biyobaskı hazırlayın. İkincisi, yardımcı programlar menüsü. Ve üçüncüsü, durum ekranı.
Biyobaskı hazırla seçeneğini belirleyin, sonra aşağı kaydırın ve giriş eksenleri seçeneğini seçin. XYZ eksenlerinin başarılı kalibrasyonunun ardından, baskı yatağının yüksekliği biraz düşecek ve yazıcı kafaları yazdırma yatağının orta noktasının üzerine yerleştirilecektir. 24 kuyu plakalarında biyobaskı için başlangıç noktası kalibrasyonuna devam etmek için, kapalı plastik ambalajından steril bir 24 kuyu kültür plakasını çıkarın ve plakanın altındaki kuyu D1'in orta noktasındaki bir noktayı kalıcı bir işaretleyici ile işaretleyin.
Plaka kapağını çıkarın ve 24 kuyulu kültür plakasını baskı yatağının sol ön köşesinde bulunan iyi D1 ile baskı yatağına yerleştirin. Ana denetim menüsünde yardımcı programlar menüsünü seçin ve ekseni taşıyın. PH1'in konik biyobaskı nozülü doğrudan iyi D1 altında işaretlenmiş noktanın üzerine gelene kadar baskı kafalarını X ve Y eksenleri boyunca bir milimetrelik artışlarla hareket ettirene kadar hareket ettirenin. Gerekirse, baskı kafalarını 0,1 milimetrelik artışlarla hareket ettirerek konik biyobaskı nozülün konumunu noktanın üzerine ince ayar yapın.
3D biyobaskı kontrol paneli ekranında belirtildiği gibi doğrudan kuyu D1'in merkezi üzerindeyken konik biyobaskı nozülün X ve Y koordinatlarını kaydedin ve koordinatları işaretleyin. Ardından, baskı yatağını bir milimetrelik artışlarla kaldırın, ta ki D1'in altı baskı kafasına monte edilmiş konik biyobaskı nozülüne neredeyse dokunana kadar. Gerekirse baskı yatağının hareketini 0,1 milimetrelik artışlarla hassas bir şekilde ayarlayın.
Yardımcı programlar menüsünden Z ekseni kalibrasyon seçeneğini seçin ve ayrıca Mağaza Z kalibrasyon seçeneğini seçin ve onaylayın. Ana menüye dönün ve biyobaskı hazırla seçeneğini belirleyin. Aşağı kaydırın ve Z'yi kalibre etme seçeneğini belirleyin.
24 kuyu plakası geometrik kodunu veya G kodunu doğru başlangıç noktası koordinatlarıyla güncelleyin. Sağlanan 24 kuyulu G-kod dosyasını biyobaskı yazılımında açın. İlk satırdaki X ve Y koordinatlarını önceki adımlarda elde edilen değerlerle güncelleştirin ve dosyayı yeni bir adla kaydedin.
Pnömatik pompanın INKREDIBLE+3D biyobaskısının arka hava giriş portuna sıkıca bağlandığından emin olun ve açın. INKREDIBLE+3D biyobaskısının sağ tarafında bulunan ileri kontrol düğmesini çıkarın. Biyobaskının ön tarafında bulunan PH1 ve PH2 dijital basınç göstergelerinin her birinin sıfır kilopaskal'a yakın okuduğundan emin olun.
PH1 için sol göstergede belirtilen basınç 12 kilopaskal olana kadar ileri kontrol düğmesini saat yönünde yavaşça döndürün. Yazıcı nozuluna dokunmamaya dikkat ederek, takılı kartuşun baskı nozulunun altına katlanmış bir kağıt kağıt veya bir parça su geçirmez sızdırmazlık filmi yerleştirin. 3D biyobaskıdaki ana kontrol menüsünden biyobaskı hazırla'yı seçin.
PH1'e gidin ve PH1'i aç'ı seçin. Biyokimyasal mürekkep baskı nozülden ekstrüde olmaya başlar unutmayın. Gerekirse, biyo mürekkede sürekli bir filamentte ekstrüde edilene kadar kontrol düğmesini saat yönünde döndürerek ekstrüzyon basıncını artırın ve yeni basınç ayarını kaydedin.
Biyokimya yatırılmasını durdurmak için PH1'i kapatın'ı seçin. Ekstrüde edilmiş biyo mürekkedeyi içeren kağıt mendili veya filmi baskı yatağından çıkarın ve biyobaskı kapısını kapatın. Rectilinear hidrojel substratlarının 24 kuyu plaka biçiminde 3D biyobaskısını gerçekleştirmek için, ana kontrol menüsünden yardımcı programlar menüsünü seçin, ardından biyobaskı yazılımının G-kod dosyalarını yazdırma için 3D biyobaskıya iletmesine izin verecek SD baskıyı devre dışı bırak'ı seçin.
Biyobaskı yazılımındaki yükle düğmesine tıklayın ve güncellenmiş 24 kuyu plakası G-code dosyasını seçin. Yazılımdaki sağ kontrol panelinde, baskı önizleme sekmesini seçin ve D1'de biyobaskı işlemine başlamak için yazdırma düğmesine tıklayın. Rektilineer yapıların biyobaskısının tamamlanmasının ardından, 24 kuyu plakasını kapağıyla örtün ve sınıf II biyogüvenlik kabinine taşıyın. Her bir rektilineer yapıyı iki damla steril 50 milimolar kalsiyum klorür çözeltisine daldırın ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya bırakın.
Kalsiyum klorür çözeltisini her kuyudan dikkatlice emiş edin ve fazla kalsiyum klorürünü çıkarmak için 1X PBS'nin bir mililitresinde bir kez durulayın. Biyobaskılı hidrojel yapılarının susuzluğunu önlemek için, kemik iliği türevi direk hücreleri yapıların üzerine tohumlamaya hazır olana kadar 3D biyobaskılı rektilinear yapıları taze 1X PBS'de tutun. Akış sitometrisi ile analiz edilen BMMC'lerin ileri ve yan dağılım parametrelerine dayanarak, en yüksek CNC konsantrasyonuna sahip hidrojel substratın, CNC agarose D-mannitol hidrojel substratlarının yokluğunda kültürlenen BMMC'lere kıyasla BMMC'lerin yerel boyutunu veya taneciklerini değiştirmediği gözlenmiştir.
BMMC'lerin propidium iyodüre geçirgenliğinin akış sitometrik analizi, test edilen CNC konsantrasyonlarının hiçbirinin BMMC canlılığı üzerinde herhangi bir olumsuz etki yaratmadığını göstermiştir. CNC agarose substratı, CNC konsantrasyonlarındaki mast hücre biyobelirteçlerinin ekspresyonunun %2,5'ten büyük veya eşit olduğunu artırdı Ancak, bu reseptörlerin ekspresyon seviyeleri% 2,5 ile% 12,5 CNC arasında nispeten tutarlı kaldı ve bu da CNC konsantrasyonundan bağımsız bir etki olduğunu gösteriyor. XTT testi, 3D biyobaskılı hidrojel iskelelerde kültürlenen BMMC'lerin metabolik aktivitesinin test edilen tüm zaman noktalarında yaklaşık% 100'de nispeten tutarlı kaldığını göstermiştir.
Benzer şekilde, LDH salınımı ve PI boya dışlama tahlilleri BMMC'lerin yaşayabilirliğinde önemli bir değişiklik olmadığını ortaya koydu. Baskı nozül göstergesinin seçimine, 3D biyobaskı eksenlerinin kalibrasyonuna dikkat edin ve ekstrüzyon basıncı ayarı yüksek kaliteli 3D yapıların tekrarlanabilir yazdırılmasını sağlayacaktır. Mast hücrelerinin alınabilme kolaylığı, hücresel işlevlerinin herhangi bir yönünü daha fazla incelemek için çok çeşitli biyolojik tahliller tarafından araştırılmalarını sağlar.
