Bu protokol, mikrobilgisayarlı tomografi kullanılarak tüm organ ölçeğinde yapısal patolojik hastalıklara mikro yapısal bakış açısı sağlar. Bu protokolde, yapısal hastalıkların seçici kontrast arttırılması ile insanlarda translasyonel büyük memeli modellerinden alınan tüm kalp örneklerinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini optimize etmek için özel bir doku hazırlama yöntemi uygulanmaktadır. Fibrozisin dağılımı ve uyarılabilir miyokardın organizasyonu gibi kardiyak mikroyapı, geniş bir kalp hastalığı spektrumunun temelini oluşturur ve hayatı tehdit eden aritmi için sahneyi hazırlar.
Prosedürü gösteren, laboratuvarım için doktora sonrası ve doktora mezunu olan Nestor Pallares-Lupon olacak. Başlamak için, sodyum heparin içeren kardiyoplejik bir çözelti hazırlayın ve çözeltiyi dört santigrat derecede saklayın. Daha sonra, 10 milimolar nihai konsantrasyon için önce bir litre damıtılmış suya EDTA ekleyerek PBS / EDTA'yı hazırlayın.
Daha sonra, EDTA'yı çözmek için sodyum hidroksit kullanarak çözeltinin pH'ını 12'de artırın ve koruyun. EDTA tamamen çözündükten sonra, hidroklorik asit kullanarak pH'ı 7.4'e düşürün. Ardından, pH 7.4 ile 0.01 molar çözelti elde etmek için bir folyo PBS torbası ekleyin.
Hazırlanan çözeltiyi oda sıcaklığında saklayın. Son olarak, bir litre mutlak etanol'e 10 gram PMA ekleyerek 1% etanol PMA kontrast madde çözeltisi hazırlayın. Hazırlanan çözeltiyi oda sıcaklığında saklayın.
Bir diseksiyon kabının 80 santimetre üzerinde desteklenen bir litrelik bir rezervuar hazırlayın ve bir termoplastik tüpü rezervuarın bir drenaj portuna yerleştirin. Drenaj borusuna üç yönlü bir musluk sabitleyin ve üç yönlü musluktaki her serbest porta birkaç termoplastik boru daha ekleyin. İki yönlü muslukları borunun serbest uçlarına sabitleyin.
Daha sonra, rezervuarı heparin ile desteklenmiş kardiyoplejik çözelti ile doldurun. Kardiyoplejik çözeltinin tüm hava kabarcıklarını çıkararak tahliye etmesine izin vermek için muslukları açın. Ardından iki yönlü muslukları kapatın.
Kalbi ötenazi yapılmış bir hayvandan çıkardıktan sonra, diseksiyona hazır olana kadar buz üzerinde depolanan soğuk kardiyoplejik çözeltiye yerleştirin. Daha sonra beş santimetre PTFE tüpünü keserek ve ucu çıplak bir alevin yanına yerleştirerek bir ucunu ısıtarak sol ve sağ koroner osteo için kanül hazırlayın. Ucun bir milimetresi erimeye başladığında ve yarı saydam hale geldiğinde, kanülün damarlardan kaymasını önlemek için kanül ucunda bir sırt şekillendirmek için ucu sert ısıya dayanıklı bir yüzeye bastırın, ardından her bir kanülün ısıtılmamış ucunun bir santimetresini drenaj rezervuarı drenaj borusunun iki ucuna yerleştirin.
Daha sonra, aort kanülünü çıkarın ve soğuk kardiyoplejik çözelti altında koroner arterlerin sol ve sağ osteosunu lokalize edin. Sivri makas kullanarak, koroner damarın altında sıfır ölçülü ipek bir sütürün ipliklenmesini sağlamak için aort kökünü koroner osteonun üstündeki ve altındaki çevreleyen dokudan dikkatlice ayırın. Ardından iki yönlü muslukları açın ve kanül uçlarını koroner osteoya yerleştirin.
Kanül uçları osteoya bir ila iki santimetre uzanarak ve dikiş yerleşiminin ötesinde, kanülü bağlayın. Daha sonra, kalp kandan temizlenene kadar ventriküllere 15 dakika boyunca hafifçe masaj yaparken kalbi durulayın. Duruladıktan sonra, iki yönlü muslukları kapatın, üç yönlü musluktan ayırın ve kalbi 500 mililitre PBS / EDTA çözeltisi içeren bir litrelik plastik kimyasal dirençli bir kaba aktarın.
PBS/EDTA çözeltisini termoplastik boruda bir duman davlumbazının altında iki kanallı peristaltik bir pompa kullanarak yeniden dolaştırın. Pompa borusunu, boru hava kabarcıkları bulunmayana kadar astarlayın. Daha sonra her koroner arter kanülünü dakikada 80 mililitrede iki saat boyunca oda sıcaklığında devridaim yoluyla inceleyin.
Duman davlumbazının çalışır durumda olduğundan emin olduktan sonra, pompayı durdurun, çözeltiyi kaptan boşaltın ve dakikada 80 mililitrede bir saat sabitlemek için% 10 formalin ile değiştirin. Kalbi, en az üç saat boyunca% 20 etanol ile başlayan bir dizi artan etanol konsantrasyonu kullanarak inceleyin. Daha sonra% 20 etanol% 30 etanol ile değiştirin ve iki saat boyunca perfüze edin.
Her iterasyonda etanol konsantrasyonunu artırarak perfüzyona devam edin ve her konsantrasyonda minimum bir saatlik perfüzyon elde edin. Hava kurumadan önce kalp dokusunu güçlendirmek için, 10 dakika boyunca eşit miktarda etanol ve HMDS karışımını ve ardından iki saat daha% 100 HMDS'yi yeniden dolaştırın. Perfüzyon pompasını durdurun, ardından kanülü borudan ayırın ve kalbi duman davlumbazının içindeki bir aort dikişinden askıya alın.
Fermuarlı kilitli bir torbayı kalbin üzerine dikkatlice kaydırın ve kalbin dolaşımdaki havaya maruz kalmasını azaltmak için torba contasını dikişin üzerine kapatın. Kalbin bir hafta boyunca buharlaşma yoluyla kurumasına izin verin. Difüzyon yükleme kontrast maddeleri için, torbayı çıkarın.
Vakum altında 48 saat boyunca% 1 PMA ile desteklenmiş% 100 etanol içine batırmadan önce% 100 etanol içinde ajitasyonla 15 dakika boyunca% 100 etanol içinde yıkayın, ardından kalbi daha önce gösterildiği gibi bir fermuarlı kilit torbasıyla örtün ve kurumasını bekleyin. Havada kurumuş kalbi uygun bir numune tutucuya monte edin. X-ışını mikro BT ölçümleri sırasında herhangi bir hareketi önlemek için, numune tutucuya tutturulmuş bir kelepçe kullanın ve kalbi kurutulmuş ve sert aort yoluyla sabitleyin.
Numune tutucuyu mikro BT tarayıcısına monte edin. Ardından, yazılımı açın ve röntgen mikro BT sistemini başlatın. Ardından x-ışını filtresi alüminyumunu bir milimetreye ayarlayın.
X-ışını kaynak voltajı 60 kilovolta ve akım 120 mikroampere kadardır. Ek olarak, görüntü boyutlarını 2.016 x 1.344 piksel ve piksel boyutunu 20 mikrometre olarak ayarlayın. Kalbin uzunlamasına erişimindeki genel görüntüleme alanını belirlemek için desteğin uzunluğu boyunca x-ışını iletim görüntülerini izleyin.
Tarama için, 360 derecelik alma seçeneğinin işaretini kaldırarak 0,18 derecelik bir döndürme adımı, ortalama beş kare ve 180 derecelik bir örnek döndürme kullanın. Örnek desteğinin tüm genişliğini görüntülemek için ofset tarama modunu seçin. Taradıktan sonra, izotropik üç boyutlu görüntü hacminin tomografik rekonstrüksiyonu için yazılımı kullanın.
Sonunda keşif yazılımında,% 10'luk ışın sertleştirme etkileri ve sekizinci halka artefaktı azaltma dahil olmak üzere edinimle ilgili artefakt düzeltmesini kullanın. Ardından, Veri Görüntüleyicisi yazılımını kullanarak yeniden yapılandırılmış veri yığınını görselleştirin. Örnekleri uzun ve kısa eksenle görüntü hacminin üç ilke ekseni ile yeniden hizalamak için örneği görüntü sınırları içinde dijital olarak yönlendirin.
Son olarak, görüntünün dış arka plan katmanlarını kaldırmak ve toplam görüntü boyutunu en üst düzeye çıkarmak için görüntü hacmini üç eksende de kırpın. Havada kurutulmuş domuz kalplerinin röntgen iletimi görüntülemesi, ventriküler boşluklar ve kas duvarı dahil olmak üzere önemli anatomik işaretleri gösterir. Üç boyutlu görüntü hacimlerinin tomografik rekonstrüksiyonları, epikardiyal ve endokardiyal sınırlarda doku ve arka plan arasında belirgin bir ayrım gösterdi.
Mason'un trikrom boyaması, subepikardiyal dokuda paravasküler olarak epitel ve endotel tabakalarında kollajen pozitif boyanma gösterdi. Parlak alan aydınlatması, PMA boyamasından sonra kollajenöz yapılarda daha koyu renklenme gösterdi ve PMA'nın tercihli birikimini destekledi. Ventriküler doku kesitlerinin PMA boyalı floresan görüntülerinde PMA'nın kollajen bölgelerinde floresan kaybına neden olduğu görüldü.
Bir kalp örneğinin hava kurumasından önce perfüzyon yoluyla kontrast madde ile boyandığı durumlarda, görüntü rekonstrüksiyonu miyokard bölmesinde oldukça yamalı lekelenme ortaya çıkardı. Dahası, düşük kontrastlı doku, arka plan yoğunluğundan zayıf bir şekilde ayrıldığını gösterdi. Kronik miyokard enfarktüsünden muzdarip bir koyun parçasının mikro BT görüntülemesinde, gevşek ve heterojen bir sınır bölgesi ile çevrili merkezi yoğun fibrotik bir lezyon saptandı.
Doku sınırlarında ve skar bölgelerinde yeniden yapılandırılmış görüntü hacimlerinin en büyük sinyal yoğunlukları burada gösterilmiştir. Kontrast maddeler sağlıklı miyokardın kötü boyanmasına rağmen mikro yapısal kontrast korunmuştur. Sınır bölgesinde, skar dokusu hayatta kalan miyokard ile serpiştirildi.
Yoğun fibrozis transmural görünümlü ancak dokulu olarak kompozisyondaki varyansları gösterir. PMA boyalı doku preparasyonunun transmural sol ventrikül bölgesi, kollajen için seçici boyama gösterdi ve hayatta kalan miyokard bölgelerinde boyanma göstermedi. Kalbin su içeriğinin etanol ile tam değişimini sağlamak için etanol kullanarak daha uzun perfüzyon süreleri önerilir.
HMDS ve su arasındaki etkileşimler, numuneye zarar verebilecek ısı üretir. Bu prosedürün güçlü bir avantajı, histoloji kullanarak mikro BT görüntülemeyi doğrulayabilmesidir. Hava yoluyla kurutulmuş numuneler, parçalama boyama ve mikroskopik görüntüleme için doğrudan parafine gömülebilir.
