Este protocolo fornece uma visão microestrusa de doenças patológicas estruturais em toda a escala de órgãos usando tomografia microcomputador. Neste protocolo, um método especializado de preparação de tecidos é implementado para otimizar imagens de alta resolução de amostras cardíacas inteiras de modelos translacionais de grandes mamíferos em humanos com aprimoramento seletivo de contraste de doenças estruturais. A microestrutura cardíaca, como a distribuição da fibrose e a organização do miocárdio excitável, sustenta um amplo espectro de doenças cardíacas e prepara o cenário para a arritmia que ameaça a vida.
Demonstrando o procedimento será Nestor Pallares-Lupon, pós-doutora e pós-graduada em meu laboratório. Para começar, prepare uma solução cardioplégica contendo heparina de sódio e armazene a solução a quatro graus Celsius. Em seguida, prepare o PBS/EDTA adicionando primeiro EDTA a um litro de água destilada para uma concentração final de 10 milimiliar.
Em seguida, aumente e mantenha o pH da solução em 12 usando hidróxido de sódio para dissolver o EDTA. Uma vez que o EDTA esteja totalmente dissolvido, abaixe o pH para 7,4 usando ácido clorídrico. Em seguida, adicione uma bolsa de folha de PBS para obter uma solução molar 0,01 com pH 7.4.
Armazene a solução preparada à temperatura ambiente. Por fim, prepare uma solução de agente de contraste PMA de 1%etanol adicionando 10 gramas de PMA a um litro de etanol absoluto. Armazene a solução preparada à temperatura ambiente.
Prepare um reservatório de um litro suportado 80 centímetros acima de uma antena de dissecção, e junte um tubo termoplástico a um porto de drenagem do reservatório. Corrija uma torneira de três vias para a tubulação de drenagem e junte mais tubos termoplásticos a cada porta livre na torneira de três vias. Corrija toques bidireis nas extremidades livres da tubulação.
Em seguida, encha o reservatório com a solução cardioplégica suplementada com heparina. Abra as torneiras para permitir que a solução cardioplégica drene a remoção de todas as bolhas de ar. Em seguida, feche as torneiras bidireis.
Depois de extrair o coração de um animal eutanizado, coloque-o em solução cardioplégica fria armazenada no gelo até estar pronto para dissecção. Em seguida, prepare a cânula para o osteo coronário esquerdo e direito cortando cinco centímetros de tubos PTFE e aquecendo uma extremidade colocando a ponta ao lado de uma chama nua. Uma vez que um milímetro da ponta comece a derreter e se torne translúcido, pressione a ponta contra uma superfície resistente ao calor para moldar um cume na ponta da cânula para evitar que a cânula escorregue para fora dos vasos, em seguida, insira um centímetro da extremidade não aquecida de cada cânula nas duas extremidades do tubo de drenagem do reservatório de drenagem.
Em seguida, remova a cânula aórtica e localize o osteo esquerdo e direito das artérias coronárias sob a solução cardioplégica fria. Utilizando uma tesoura pontiaguda, separe cuidadosamente a raiz aórtica do tecido circundante acima e abaixo do osteo coronário para permitir a rosca de uma sutura de seda de bitola zero sob o vaso coronário. Em seguida, abra as torneiras bidireis e insira as pontas da cânula no osteo coronário.
Com as pontas da cânula estendendo de um a dois centímetros para o osteo e além da colocação da sutura, amarre a cânula. Em seguida, enxágue o coração enquanto massageia suavemente os ventrículos por 15 minutos até que o coração esteja limpo de sangue. Após enxaguar, feche as torneiras bidireis, desconecte-as da torneira de três vias e transfira o coração para um recipiente químico resistente a plástico de um litro contendo 500 mililitros de solução PBS/EDTA.
Recircular a solução PBS/EDTA no tubo termoplástico sob um capô de fumaça usando uma bomba peristáltica com dois canais. Prime a tubulação da bomba até que a tubulação esteja ausente de bolhas de ar. Em seguida, peruse cada cânula da artéria coronária por recirculação à temperatura ambiente por duas horas a 80 mililitros por minuto.
Depois de garantir que o capô da fumaça esteja operacional, pare a bomba, escorra a solução do recipiente e substitua-a por 10% de formalina para fixação por uma hora a 80 mililitros por minuto. Peruse o coração usando uma série de concentrações incrementais de etanol, começando com 20% de etanol por um mínimo de três horas. Em seguida, substitua o etanol de 20% por 30% de etanol e perutil por duas horas.
Continue a perfusão aumentando a concentração de etanol em cada iteração com perfusão mínima de uma hora em cada concentração. Para reforçar o tecido cardíaco antes da secagem do ar, recircular uma mistura igual de etanol e HMDS por 10 minutos seguido por 100% HMDS por mais duas horas. Pare a bomba de perfusão, em seguida, desconecte a cânula da tubulação e suspenda o coração de uma sutura aórtica dentro do capô da fumaça.
Deslize cuidadosamente um saco de fecho sobre o coração e feche o selo do saco sobre a sutura para reduzir a exposição do coração ao ar circulante. Deixe o coração secar durante uma semana. Para agentes de contraste de carregamento de difusão, remova o saco.
Lave o coração em 100% etanol por 15 minutos com agitação antes de imergi-lo em 100% etanol suplementado com 1%PMA por 48 horas sob vácuo, em seguida, cubra o coração com um saco zip lock como demonstrado anteriormente e deixe-o secar. Monte o coração seco de ar em um suporte de amostra apropriado. Para evitar qualquer movimento durante as medições de microC de raio-x, use um grampo ancorado no suporte da amostra e fixe o coração através da aorta seca e rígida.
Monte o suporte de amostra no scanner micro CT. Em seguida, abra o software e inicie o sistema de microCs de raios-X. Em seguida, coloque o filtro de raios-X em alumínio de um milímetro.
Tensão de fonte de raios-X para 60 quilovolts e corrente para 120 microamperes. Além disso, defina as dimensões da imagem para 2.016 por 1.344 pixels e tamanho de pixel para 20 micrômetros. Imagens de transmissão de raios-X scout ao longo do comprimento do suporte para determinar o campo de imagem geral no acesso longitudinal do coração.
Para a digitalização, use uma etapa de rotação de 0,18 graus, uma média de quadro de cinco e uma rotação amostral de 180 graus, desmarcando a opção para uma aquisição de 360 graus. Selecione o modo de varredura offset para imagem de toda a largura do suporte à amostra. Após a varredura, use o software para reconstrução tomográfica de um volume de imagem tridimensional isotrópica.
No software final de reconhecimento, use a correção de artefatos relacionados à aquisição, incluindo efeitos de endurecimento do feixe de 10% e redução de artefato de anel de oito. Em seguida, usando o software Data Viewer, visualize a pilha de dados reconstruída. Oriente digitalmente a amostra dentro dos limites da imagem para realinhar as amostras de eixo longo e curto com o três princípio um eixo do volume de imagem.
Finalmente, corte o volume de imagem em todos os três eixos para remover camadas externas de fundo da imagem e reduzir ao máximo o tamanho total da imagem. Imagens de transmissão de raios-X de corações de porco secos mostram grandes marcos anatômicos, incluindo as cavidades ventriculares e a parede muscular. Reconstruções tomográficas de volumes de imagem tridimensional mostraram separação distinta entre tecido e fundo nas fronteiras epicárida e endócara.
A coloração tricrômica de Mason mostrou manchas positivas de colágeno nas camadas epiteliais e endoteliais paravascularmente no tecido sub-epicárdio. A iluminação de campo brilhante mostrou coloração mais escura em estruturas colágenas após a coloração do PMA, suportando o acúmulo preferencial de PMA. Imagens fluorescentes manchadas de PMA de seções de tecido ventricular tiveram perda induzida por PMA de fluorescência em locais de colágeno.
Quando uma amostra de coração manchada com um agente de contraste via perfusão antes da secagem do ar, a reconstrução da imagem revelou manchas altamente irregulares dentro do compartimento do miocárdio. Além disso, o tecido de baixo contraste mostrou baixa separação da intensidade de fundo. A micro tomografia de uma parte de ovelha que sofre de infarto crônico do miocárdio revelou uma lesão fibrosa central densa cercada por uma zona de fronteira solta e heterogênea.
As maiores intensidades de sinal de volumes de imagem reconstruídas nas fronteiras teciduais e regiões cicatrizadas são mostradas aqui. Os agentes de contraste mancharam mal o miocárdio saudável, mas o contraste micro estrutural foi mantido. Na zona de fronteira, o tecido cicatricial foi intercalado com o miocárdio sobrevivente.
A fibrose densa apareceu transmural, mas texturizada indicando variâncias na composição. A região ventricular esquerda transmural da preparação de tecido manchado da PMA mostrou coloração seletiva para colágeno e nenhuma coloração em regiões de miocárdio sobrevivente. Recomenda-se maiores tempos de perfusão usando etanol para garantir a troca completa do conteúdo de água do coração com etanol.
As interações entre o HMDS e a água produzem calor, o que pode danificar a amostra. Uma grande vantagem deste procedimento é a capacidade de validar micro tomografias usando histologia. Amostras secas de ar podem ser diretamente incorporadas em parafina para coloração de secção e imagens microscópicos.
