פרוטוקול זה מספק תובנה מיקרו-מבנית על מחלות פתולוגיות מבניות בכל קנה המידה של האיברים באמצעות טומוגרפיה של מיקרו-מחשבים. בפרוטוקול זה מיושמת שיטת הכנת רקמות מיוחדת כדי לייעל הדמיה ברזולוציה גבוהה של דגימות לב שלמות ממודלים תרגומיים של יונקים גדולים בבני אדם עם שיפור ניגודיות סלקטיבי של מחלות מבניות. המיקרו-מבנה הלב כגון התפלגות הפיברוזיס וארגון שריר הלב הנרגש עומד בבסיס ספקטרום רחב של מחלות לב ומכין את הקרקע להפרעת קצב מסכנת חיים.
מי שידגים את ההליך יהיה נסטור פאלארס-לופון, פוסט-דוקטורנט בוגר המעבדה שלי. כדי להתחיל, להכין תמיסה cardioplegic המכיל נתרן הפרין ולאחסן את הפתרון על ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו PBS/EDTA על ידי הוספה ראשונה של EDTA לליטר אחד של מים מזוקקים לריכוז סופי של 10 מילימולר.
לאחר מכן להגדיל ולשמור על ה- pH של הפתרון ב 12 באמצעות נתרן הידרוקסיד כדי להמיס את EDTA. לאחר שה-EDTA מומס במלואו, הורידו את ה-pH ל-7.4 באמצעות חומצה הידרוכלורית. לאחר מכן הוסף שקית נייר כסף אחת של PBS כדי לקבל תמיסת טוחנת 0.01 עם pH 7.4.
אחסנו את הפתרון המוכן בטמפרטורת החדר. לבסוף, הכינו תמיסת סוכן ניגודיות PMA של 1%אתנול על ידי הוספת 10 גרם PMA לליטר אחד של אתנול מוחלט. אחסנו את הפתרון המוכן בטמפרטורת החדר.
מכינים מאגר של ליטר אחד הנתמך 80 ס"מ מעל צלחת כריתה, ומצמידים צינור תרמופלסטי לנמל ניקוז של המאגר. קבעו ברז תלת-כיווני לצינורות הניקוז והצמידו צינורות תרמופלסטיים נוספים לכל יציאה פנויה על הברז התלת-כיווני. תקן הקשות דו-כיווניות לקצוות החופשיים של הצינורות.
לאחר מכן, למלא את המאגר עם תמיסה cardioplegic בתוספת הפרין. פתחו את הברזים כדי לאפשר לתמיסת הלב-ריאה להתנקז ולהסיר את כל בועות האוויר. לאחר מכן סגרו את הברזים הדו-כיווניים.
לאחר חילוץ הלב מבעל חיים מורדם, מניחים אותו בתמיסה לב-ריאה קרה המאוחסנת על קרח עד שהיא מוכנה לנתיחה. לאחר מכן הכינו צינורית לאוסטאו הכלילי השמאלי והימני על ידי חיתוך חמישה סנטימטרים של צינורות PTFE וחימום קצה אחד על ידי הנחת הקצה ליד להבה עירומה. ברגע שמילימטר אחד של הקצה מתחיל להתמוסס והופך שקוף, לחץ את הקצה על משטח עמיד בחום קשה כדי לעצב רכס בקצה הצינורית כדי למנוע מהצינורית להחליק מתוך הכלים, ואז הכנס סנטימטר אחד של הקצה הלא מחומם של כל צינורית לשני הקצוות של צינורית הניקוז של מאגר הניקוז.
לאחר מכן, הסר את צינורית אבי העורקים ולמקם את האוסטאו השמאלי והימני של העורקים הכליליים תחת תמיסת הלב הקר. באמצעות מספריים מחודדים, מפרידים בזהירות את שורש אבי העורקים מהרקמה הסובבת מעל ומתחת לאוסטאו הכלילי כדי לאפשר השחלה של תפר משי בעל מד אפס מתחת לכלי הכלילית. לאחר מכן פתחו את הברזים הדו-כיווניים והכניסו את קצות הצינורית לתוך האוסטאו הכלילי.
כאשר קצות הצינורית נמתחים סנטימטר עד שני סנטימטרים לתוך האוסטאו ומעבר למיקום התפר, קושרים את הצינורית. לאחר מכן, לשטוף את הלב תוך עיסוי עדין של החדרים במשך 15 דקות עד שהלב מתנקה מדם. לאחר השטיפה, סגרו את הברזים הדו-כיווניים, נתקו אותם מהברז התלת-כיווני והעבירו את הלב למיכל פלסטיק אחד ליטר עמיד בפני כימיקלים המכיל 500 מיליליטרים של תמיסת PBS/EDTA.
שחזרו את תמיסת ה-PBS/EDTA בצינורות התרמופלסטיים מתחת למכסה אדים באמצעות משאבה פריסטלטית עם שני ערוצים. מכינים את צינורות המשאבה עד שהצינורות נעדרים בועות אוויר. לאחר מכן יש לעיין בכל צינורית עורק כלילי על ידי סירקולציה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים ב-80 מיליליטר לדקה.
לאחר הקפדה על הפעלת מכסה האדים, עצרו את המשאבה, נקזו את התמיסה מהמיכל והחליפו אותה ב-10% פורמלין לקיבוע למשך שעה אחת ב-80 מיליליטר לדקה. מעיינים בלב באמצעות סדרה של ריכוזי אתנול מצטברים, החל מ-20% אתנול למשך שלוש שעות לפחות. לאחר מכן החליפו את ה-20% אתנול ב-30% אתנול ותחליפו אותה במשך שעתיים.
המשך את הזלוף על ידי הגדלת ריכוז האתנול בכל איטרציה עם זלוף מינימלי של שעה אחת בכל ריכוז. כדי לחזק את רקמת הלב לפני ייבוש האוויר, יש לשחזר תערובת שווה של אתנול ו-HMDS למשך 10 דקות ולאחר מכן 100% HMDS למשך שעתיים נוספות. עצרו את משאבת הזלוף, ואז נתקו את הצינורית מהצינוריות והשעו את הלב מתופר אבי העורקים בתוך מכסה המנוע של האדים.
החליקו בזהירות שקית נעילת רוכסן על הלב וסגרו את אטם השקית מעל התפר כדי להפחית את החשיפה של הלב לאוויר המסתובב. אפשרו ללב להתייבש באמצעות אידוי במשך שבוע. עבור חומרי ניגוד להעמסת דיפוזיה, הסר את השקית.
יש לשטוף את הלב ב-100%אתנול במשך 15 דקות עם תסיסה לפני שאתם טובלים אותו ב-100% אתנול בתוספת 1%PMA למשך 48 שעות תחת ואקום, ואז מכסים את הלב בשקית רוכסן כפי שהודגם קודם לכן ומאפשרים לו להתייבש. הרכיבו את הלב המיובש באוויר על מחזיק הדגימה המתאים. כדי למנוע כל תזוזה במהלך מדידות המיקרו CT של קרני הרנטגן, השתמשו במהדק המעוגן למחזיק הדגימה ואבטחו את הלב באמצעות אבי העורקים המיובש והנוקשה.
הרכיבו את מחזיק הדגימה בסורק המיקרו-CT. לאחר מכן, פתח את התוכנה ויזם את מערכת המיקרו CT של קרני רנטגן. לאחר מכן הגדר את מסנן הרנטגן אלומיניום למילימטר אחד.
מתח מקור רנטגן ל 60 קילובולטים וזרם ל 120 מיקרואמפרים. בנוסף, הגדר את ממדי התמונה ל- 2, 016 על 1, 344 פיקסלים וגודל פיקסלים ל- 20 מיקרומטר. תצפית על צילומי רנטגן לאורך התמיכה כדי לקבוע את שדה ההדמיה הכולל בגישה האורכית של הלב.
לצורך סריקה, השתמש בשלב סיבוב של 0.18 מעלות, מסגרת ממוצעת של חמש וסיבוב מדגם של 180 מעלות על ידי ביטול הבחירה באפשרות לרכישה של 360 מעלות. בחר במצב סריקת היסט כדי לצלם את כל רוחב התמיכה לדוגמה. לאחר הסריקה, השתמש בתוכנה לשחזור טומוגרפי של נפח תמונה תלת מימדי איזוטרופי.
בסופו של דבר תוכנת recon, השתמש בתיקון ממצאים הקשורים לרכישה, כולל השפעות התקשות קרן של 10% והפחתת חפץ טבעתי של שמונה. לאחר מכן, באמצעות תוכנת Data Viewer, הצג באופן חזותי את מחסנית הנתונים המשוחזרת. לכוון באופן דיגיטלי את הדגימה בתוך גבולות התמונה כדי להתאים מחדש את הציר הארוך והקצר של הדגימות עם שלושת העקרונות של ציר נפח התמונה.
לבסוף, חתוך את עוצמת הקול של התמונה בכל שלושת הצירים כדי להסיר שכבות רקע חיצוניות של התמונה ולהפחית באופן מרבי את גודל התמונה הכולל. הדמיית שידור רנטגן של לבבות חזירים מיובשים באוויר מראה ציוני דרך אנטומיים עיקריים כולל חללי החדר וקיר השריר. שחזורים טומוגרפיים של נפחי תמונה תלת-ממדיים הראו הפרדה ברורה בין רקמה לרקע בגבולות אפיקרדיאליים ואנדוקרדיאליים.
צביעת הטריכרום של מייסון הראתה כתמים חיוביים של קולגן בשכבות האפיתל והאנדותל באופן פרא-וסקולרי ברקמה התת-אפיקרדיאלית. תאורת שדה בהיר הראתה צבע כהה יותר במבנים קולגן לאחר צביעת PMA, מה שתומך בהצטברות המועדפת של PMA. תמונות פלואורסצנטיות מוכתמות של PMA של מקטעי רקמות חדריות גרמו ל-PMA לגרום לאובדן פלואורסצנציה באתרים של קולגן.
כאשר דגימת לב מוכתמת בחומר ניגוד באמצעות זלוף לפני ייבוש האוויר, שחזור התמונה חשף כתמים מטושטשים מאוד בתוך תא שריר הלב. יתר על כן, רקמת ניגודיות נמוכה הראתה הפרדה לקויה מעוצמת הרקע. הדמיית מיקרו CT של חלק כבשה הסובל מאוטם שריר הלב כרוני חשפה נגע פיברוטי מרכזי וצפוף המוקף באזור גבול רופף והטרוגני.
עוצמות האות הגדולות ביותר של נפחי תמונה משוחזרים בגבולות הרקמה ובאזורי הצלקת מוצגות כאן. חומרי הניגודיות הכתימו בצורה גרועה את שריר הלב הבריא, אך הניגודיות המיקרו-מבנית נשמרה. באזור הגבול, רקמת הצלקת הייתה שזורה בשריר הלב ששרד.
פיברוזיס צפוף נראה טרנסמורלי אך בעל מרקם המצביע על שונות בהרכב. אזור החדר השמאלי הטרנסמורלי של הכנת רקמות מוכתמות PMA הראה כתמים סלקטיביים לקולגן וללא כתמים באזורים של שריר הלב ששרדו. זמני זלוף ארוכים יותר באמצעות אתנול מומלצים כדי להבטיח החלפה מלאה של תוכן המים של הלב עם אתנול.
אינטראקציות בין HMDS למים מייצרות חום, שעלול לפגוע בדגימה. יתרון חזק של הליך זה הוא היכולת לאמת הדמיית מיקרו CT באמצעות היסטולוגיה. דגימות מיובשות באוויר יכולות להיות מוטמעות ישירות בפרפין לצורך חתך כתמים, והדמיית מיקרוסקופ.
