Burada, pluripotent mezenkimal hücrelerin infüzyonu gibi terapötik adımların kullanımı için iyi ve uygulanabilir hücrelerin elde edilmesi ve korunması için protokolü gösterdik. Bunun temel avantajı, bu tekniği kullanarak, toplanan dokudan hücrelerin izolasyon adımında kazanılan zamana karşı canlı hücre hacmini elde edebilmemizdir. Bu teknik, heterojenik ilaç ve hücre tedavisinin uygulandığı tüm hastalıklara veya koşullara genişletilebilir.
Bu yöntem, uzun süreli hücre kültürlerinin teşvik edilebileceği ilaç testi gibi alanlarda sitogenomik stabilite testine de uygulanabilir. Canlı hücreleri manipüle ederken, sakin ve kendinden emin olun. Sepsis ile aşırı dikkatli olun ve herhangi bir sıkıntıyı gözlemlemek ve iyi kararlar vermek için bir bilim adamının gözleriyle sürekli uyanık olun.
Torbayı tartarak ve sıcaklığı dijital temassız kızılötesi klinik termometre ile ölçerek başlayın. Yağlı tabakaları çökeltmek ve hücreleri içeren dokuyu ayırmak için torbayı laminer akış odasının içinde beş dakika bekletin. Transfer torbasına kalsiyum içeren 100 mililitre DPBS enjekte edin ve ellerinizle karıştırın.
Beş dakika bekletin. Ardından, çökelen bazal sıvının çoğunu atmak için torba adaptörüne bağlı 60 mililitrelik bir şırınga kullanın. Bu işlemi iki kez tekrarlayın.
Torbaya 100 mililitre sindirim çözeltisi ekleyin ve yavaş karıştırma altında 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bırakın. Daha sonra torbanın tüm içeriğini dört adet 50 mililitrelik konik tüpe aktarın ve 22 santigrat derecede 10 dakika boyunca 400G'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücre peletine% 20 fetal sığır serumu ile desteklenmiş 5 mililitre DMEM düşük glikoz ekleyin.
Damıtılmış suda% 0.05'te 10 mikrolitre tripan mavisinden oluşan taze bir çözeltiyi, beş dakika boyunca 10 mikrolitre hücresel süspansiyonla karıştırın. 20X büyütmede ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanın ve Neubauer hücre sayma odasındaki canlı hücreleri sayın. Hücre peletini kriyo-koruyucu bir ortamda, mililitre başına 1 milyon hücre konsantrasyonunda askıya alın.
Daha sonra bu karışımın 1 mililitresini kriyo şişelere yerleştirin. Dakikada 1 santigrat derece soğutma hızına sahip bir dondurma kabı kullanın ve bir yıl boyunca 80 santigrat derecede saklayın. Bir yıl sonra, sıvı azot buharı fazına batırılmış standart kaset kutularında saklayın.
Dokuz hastadan alınan prosedürün farklı basamaklarından elde edilen veriler bu tabloda sunulmuştur. İlk hücresel verime göre, her örnek için değişken bir hücre hacmi belirlendi. Daha yüksek hücresel verime sahip 1 mililitre numune, orta hücresel verime sahip numuneler için 1,1 mililitre ve daha düşük hücresel verime sahip numuneler için 2 mililitre.
Birinci geçişten önceki hücresel verim, tripsinizasyondan önceki aynı birleşme gözlendiğinde bile geniş ölçüde değişmiştir. Bu nedenle, burada hücreler katmanlar halinde büyümüş olabilir. Temsili görüntü, ışık mikroskobunda izolasyondan sonraki ilk pasajda plastiğe yapışan mezenkimal ADSC'leri göstermektedir.
Hücreler plastik ve fibroblast benzeri morfolojiye yapışma gösterir. Neubauer odasında tripan mavisi tahlilinde sayılan canlı hücreler burada gösterilmiştir. Bu tabloda altı hastanın akım sitometrisi verileri sunulmuştur.
Bu CD45 negatif hücrelerden, kök hücre belirteçlerinin farklı kombinasyonlarına sahip ADSC'lerin yüzdesi belirlendi. Temsili görüntüler, sekiz aylık kriyo-korumadan sonra dokuzuncu vakanın SVF'sinde kök hücre ile ilişkili belirteçler için pozitif olan hücrelerin alt popülasyonunu göstermektedir. Burada, R1, ileri dağılıma karşı yan dağılım grafiğinde analiz edilen toplam hücresel bölgedir.
Ve R2, CD45 negatif bölgesidir. CD73, CD90 ve CD105 popülasyonları bu bölgede pozitiftir. Kondrositler, osteositler ve adipositlerde ADSC farklılaşması burada gösterilmiştir.
Bu prosedürü denerken, yapışmaları ve kabarmaları gözlemlemek için 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bırakırken, tercihen ellerinizle yavaşça karıştırmayı unutmayın. Çalışma odası sıcaklığını 25 santigrat derece civarında tutun ve çok daha büyük sıcaklıklarda herhangi bir termal şoktan kaçının. Burada gösterdiğimiz teknik, pluripotent mezenkimal hücreleri diğer dokulardan başarılı bir şekilde izole etmek için kullanılabilir.
