Bıçak yarası yaralanması, nonspesifik hücre ablasyonunu indükleyen mekanik bir yaralanma yöntemidir. Bu yöntem, beyin hasarı sonrası RGC proliferasyonu ve farklılaşmasının değerlendirilmesini kolaylaştırır. İğne aracılı bıçak yarası yaralanması, beyin hasarını indüklemek için basit, etkili bir şekilde uygulanan bir yöntemdir.
Bu yöntem, standart bir araç seti kullanılarak birçok deneysel numuneye uygulanabilir. Zebra balıklarının rejeneratif kapasitesi, bıçak yarası yaralanma modeli kullanılarak gösterilmiştir. Nöronal rejenerasyonu düzenleyen moleküler mekanizmaya yeni bakış açıları, merkezi sinir sisteminde rejeneratif tedaviye katkıda bulunur.
Anestezi uygulanmış yetişkin bir zebra balığı veya medaka'yı strafor tepsiye yerleştirerek başlayın. Balıkları, straforun içine dikey olarak yerleştirilmiş iki adet 30 gauge iğne arasına dik olarak sabitleyin. Balık kafasının hareket etmesini önlemek için balık gövdesini tutun ve ardından kafatasından optik tektum kürelerinden birinin medial bölgesine dikey olarak 30 gauge'lik bir iğne yerleştirin.
Daha sonra, yaralı balıkları taze balık tesisi suyu olan bir balık tankına aktarın. Balıklar anesteziden tamamen iyileştikten sonra, tankı üreme sistemine taşıyın. Anestezi uygulanan balıkları yerleştirmek için strafor tepsiye kağıt havlu koyun.
Ardından, anal yüzgecin her iki tarafına dikey olarak iki adet 30 gauge iğne yerleştirerek balık gövdesini yerinde tutun. Balık yerleştirildikten sonra, anüsten kalbe ventral bir kesi yapın. Her iki tarafa iki adet 30 gauge iğne yerleştirerek kalbi görünür tutun.
Daha sonra gümüş epitel tabakasını çıkarmak için forsepsin ucunu kullanın. 30 gauge iğneyi ventriküle yerleştirin, eğimi yukarıda tutun ve forsepsleri kullanarak atriyuma bir kesi yapın. Daha sonra, kanı atriyumdan temizlemek için şırıngaya bastırarak PBS'yi atriyuma itin.
Kan boşaltıldığında ve solungaçlar beyaza döndüğünde, PBS perfüzyonunu durdurun. Daha sonra, balık gövdesini yerine sabitleyen iğneleri çıkarın ve balık ventral tarafını aşağı doğru sabitleyin. Omuriliği kestikten ve kafatasını optik tektumdan ve telensefalondan çıkardıktan sonra, optik sinirleri kesin ve beyni diseke edin.
Daha sonra, beyinleri PBS'de bir mililitre% 4 paraformaldehit içeren 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve gece boyunca dört santigrat derecede sabitleyin. Sabit beyinleri PBS'de her biri beş dakika boyunca üç kez yıkadıktan sonra, beyinleri PBS'de kriyoprotektan olarak hacimce% 30 ağırlığında bir mililitre ile 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. % 30 sakkarozu 30 mililitre optimum kesme sıcaklığı veya OCT, bileşiği ile birleştirerek gömme bileşiğini hazırlayın ve bileşiği dört santigrat derecede saktora saklayın.
Kriyomoldu bir kez soğutmak için, bir alüminyum bloğu gece boyunca eksi 80 santigrat derecede inkübe edin ve önceden soğutulmuş bloğu ısınmayı önlemek için kapaklı bir strafor kutuya koyun. Koronal kesitler için, mikroskop altında forseps kullanarak oryantasyonu ayarlayarak disseke edilmiş beyni bir kriyomolda gömün. Daha sonra, kriyomoldu strafor kutudaki önceden soğutulmuş alüminyum blok üzerine yerleştirin ve OCT bileşiğinin donmasına ve beyazlaşmasına izin verin.
Bileşik donduğunda, kriyobloğu numune diskine monte etmeden önce bir numune diskine küçük bir OCT bileşiği çemberi uygulayın. Numune diskini kriyostata yerleştirerek, OCT bileşiğini dondurun. Daha sonra numune diskini kriyostattaki numune kafasına yerleştirin.
Kriyoblokun yönünü ayarladıktan sonra, ekstra bölgeleri çıkarmak için OCT'yi kırpın. Bir kriyostat kullanarak tüm optik tektum boyunca 14 mikrometre kalınlığında seri kesitleri kesin ve slaytları eksi 25 santigrat derecede saklayın. Zebra balıklarının beyin dokusundaki radyal glial hücre veya RGC proliferasyonu değerlendirildi.
RGC'lerin çoğu, kontralateral yaralanmamış yarımkürede proliferasyon yapan hücre antijeni negatifti. Yaralanmadan iki gün sonra, medaka tektumunun yaralı tarafında RGC proliferasyonu indüklendi. Beyin hasarından sonra, hücre soyu ve RGC farklılaşması bromodeoksiüridin veya BrdU etiketlemesi ile değerlendirildi.
Temsili analiz, yaralı zebra balığı ve medaka'da yaralanmadan yedi gün sonra yenidoğan nöronlarını göstermektedir. Bıçak yarası yaralanmalarında kritik adımlardan biri manuel iğne yerleştirmedir. Tekrarlanabilir sonuçlar yaratmak için tutarlı bir yaralanma gereklidir.
Floresan boyalar yara belirteçleri olarak etkilidir. Floresan boya difüzyonunun derecesi, bıçak yarası yaralanmasının yerini ve derinliğini gösterir. Bu teknik potansiyel olarak diğer küçük balık türlerine uyarlanmıştır ve medaka'ya adaptasyon, rejeneratif kapasitenin karşılaştırılmasına izin verir.
