刺し傷損傷は、非特異的な細胞アブレーションを誘発する機械的損傷方法です。この方法は、脳損傷後のRGC増殖および分化の評価を容易にする。針介在性刺創損傷は、脳損傷を誘発するための簡単で効率的に実施される方法です。
この方法は、標準的なツールセットを使用して多くの実験サンプルに適用できます。ゼブラフィッシュの再生能力は、刺し傷モデルを使用して示されました。神経細胞の再生を制御する分子機構に関する新たな知見は、中枢神経系の再生治療に貢献しています。
麻酔をかけた成体のゼブラフィッシュまたはメダカを発泡スチロールのトレイに置くことから始めます。発泡スチロールに垂直に挿入された2本の30ゲージの針の間に魚を直立させます。魚の頭が動かないように魚体を持ってから、頭蓋骨を通して30ゲージの針を視蓋球の1つの内側領域に垂直に挿入します。
次に、負傷した魚を鮮魚施設の水の入った水槽に移します。魚が麻酔から完全に回復したら、タンクを繁殖システムに移動します。発泡スチロールのトレイにペーパータオルを置き、麻酔をかけた魚を置きます。
次に、肛門鰭の両側に2本の30ゲージの針を垂直に挿入して、魚体を所定の位置に保持します。魚を配置したら、肛門から心臓まで腹側を切開します。両側に2本の30ゲージの針を挿入して、心臓が見えるようにします。
次に、鉗子の先端を使用して銀の上皮層を取り除きます。30ゲージの針を心室に挿入し、斜角を上に保ち、鉗子を使用して心房を切開します。次に、注射器を押し下げて心房から血液を洗い流し、PBSを心房に押し込みます。
血液が排出され、えらが白くなったら、PBS灌流を停止します。その後、魚体を所定の位置に固定している針を外し、魚の腹側を下にして固定します。脊髄を切断し、視蓋と終脳から頭蓋骨を切除した後、視神経を切断して脳を解剖します。
次に、脳をPBSに1ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドを入れた1.5ミリリットルのチューブに移し、摂氏4度で一晩固定します。固定した脳をPBSで3回、それぞれ5分間洗浄した後、凍結保護剤としてPBS中の30体積重量%ショ糖を1ミリリットル入れた1.5ミリリットルのチューブに脳を移し、摂氏4度で一晩インキュベートします。30%ショ糖と30ミリリットルの最適切断温度(OCT)を配合して包埋コンパウンドを調製し、4°Cで保存します。
クライオモールドを一度冷却するには、アルミブロックをマイナス80°Cで一晩インキュベートし、予冷したブロックを蓋付きの発泡スチロールの箱に入れて温まりを防ぎます。冠状切片の場合は、顕微鏡下で鉗子を使用して向きを調整することにより、解剖した脳をクライオモルドに埋め込みます。次に、発泡スチロールボックス内の予冷アルミニウムブロックにクライオモールドを置き、OCTコンパウンドを凍結させて白くします。
化合物が凍結したら、クライオブロックを試料ディスクに取り付ける前に、OCT化合物の小さな円を試料ディスクに塗布します。試料ディスクをクライオスタットに入れて、OCTコンパウンドを凍結します。次に、検体ディスクをクライオスタットの検体ヘッドに置きます。
クライオブロックの向きを設定したら、OCTをトリミングして余分な領域を削除します。クライオスタットを使用して光学蓋全体を通して厚さ14マイクロメートルのシリアル切片を切り取り、スライドを摂氏マイナス25度で保管します。ゼブラフィッシュの脳組織における放射状グリア細胞(RGC)の増殖を評価した。
ほとんどのRGCは、反対側の損傷を受けていない半球で細胞抗原陰性を増殖していました。受傷後2日目にメダカ腱の負傷側にRGC増殖が誘導された.脳損傷後、細胞系譜およびRGC分化をブロモデオキシウリジン(BrdU)標識で評価した。
代表的な分析は、負傷したゼブラフィッシュとメダカの損傷後7日目の新生児ニューロンを示しています。刺し傷の重要なステップの1つは、手動の針挿入です。再現性のある結果を得るには、一貫した損傷が必要です。
蛍光色素は創傷マーカーとして有効である。蛍光色素の拡散の程度は、刺し傷傷害の位置および深さを示す。この技術は他の小魚種にも適応できる可能性があり、メダカへの適応は再生能力の比較を可能にします。
